Cora Teza Doctorat Cuprins

Teza de doctorat SEMNIFICAŢIA MECANISMELOR MOLECULARE IMPLICATE ÎN TRANSFORMAREA CELULARĂ CU PAPILOMAVIRUSURI UMANE (HPV) PENTRU MONITORIZAREA UNOR CANCERE UMANE Cuprins INTRODUCERE Capitolul 1. ARGUMENTE PRIVIND IMPLICAREA INFECŢIEI HPV ÎN PATOLOGIA UMANĂ Capitolul 2. CARACTERIZAREA GENERALĂ A PAPILOMAVIRUSURILOR 2.1 Clasificarea papilomavirusurilor 2.2. Proprietăţile morfologice şi de cultivare ale papilomavirusurilor umane Capitolul 3. REPLICAREA HPV ŞI IMPLICAŢIILE DIFERITELOR PROTEINE VIRALE ÎN ONCOGENEZĂ 3.1. Sinteza proteinelor HPV 3.2. Relaţia dintre ciclul de replicare al papilomavirusurilor şi oncogeneză Capitolul 4. PATOGENIA INFECŢIEI HPV 4.1. Manifestările clinice ale infecţie cu HPV 4.2. Mecanismele moleculare ale transformării maligne în infecţia HPV 4.2.1. Implicarea proteinelor E6 în transformare 4.2.2. Implicarea proteinelor E7 în transformare 4.2.3. Implicarea proteinelor E2 în transformare 4.2.4. Implicarea proteinelor E5 în transformare Capitolul 5. EPIDEMIOLOGIA INFECŢIEIE HPV ŞI A CANCERELOR ASOCIATE Capitolul 6. CORELAŢIA ÎNTRE ELUDAREA IMUNĂ ŞI ONCOGENITATE ÎN INFECŢIA HPV 6.1. Consideraţii generale privind protecţia antitumorală 6.2. Rolul inflamaţiei cronice în dezvoltarea cancerului 6.3. Mecanismele eludării immune specifice infecţiei HPV 6.3.1. Menţinerea infecţiei la niveluri scăzute 6.3.2. Exploatarea redundanţei codului genetic 6.3.3. Mimarea proteinelor gazdă 6.3.4. Modularea prezentării antigenelor tumorale 6.3.5. Interferenţa cu producere de interferon 6.3.6. Inhibarea citokinelor şi a chemoatractanţilor 6.3.7. Distorsionarea profilului citokinelor 6.3.8. Modularea expresiei moleculelor de adeziune 6.3.9. Inhibarea migrării celulelor prezentatoare de antigen 6.3.10. Prevenirea apoptozei 6.4. Relaţia dintre capacitatea de transformare şi evaziunea imună 6.4.1. Diferenţe între mecanismele de evaziune imună ale HPV de risc crescut şi HPV de risc scăzut 6.4.2. Diferenţe între variantele HPV, capacitatea de transformare şi evaziunea imună Capitolul 7. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIEI HPV ŞI AL CANCERELOR ASOCIATE 7.1. Diagnosticul precoce al leziunilor precursoare şi cancerului de col uterin 7.1.1. Examenul citologic

1 10 15 15 19 21 21 26 32 32 34 35 43 49 52 57 68 68 72 74 75 76 76 77 78 80 80 81 82 82 83 83 84

85 85 85

1

7.1.2. Examenul histologic 7.1.3. Detecţia ADN HPV şi a markerilor moleculari specifici 7.2. Diagnosticul infecţiei HPV la nivelul căilor respiratorii superioare Capitolul 8. PROFILAXIA ŞI TRATAMENTUL ÎN BOLILE ASOCIATE INFECŢIEI HPV 8.1. Prevenirea cancerelor ano-genitale 8.2. Tratamentul bolilor ano-genitale asociate infecţiei HPV 8.3. Profilaxia şi tratamentul cancerelor căilor respiratorii superioare Contribuţii originale Scopul şi obiectivele tezei Capitolul 9. MATERIALE ŞI METODE 9.1. Constituirea loturilor de pacienţi şi metodele de investigare 9.2. Depistarea şi stadializarea cancerului de col uterin 9.2.1. Examenul citologic 9.2.2. Inspecţia vizuală a cervixului / Colposcopia 9.2.3. Examenul anatomo-patologic 9.3. Stadializarea clinică a cancerelor laringo-faringiene 9.4. Tehnici de izolare şi de estimare cantitativă /calitativă a ARN/ADN total 9.4.1. Izolarea ADN celular total prin metoda standard 9.4.2. Extracţia ADN din sângele periferic 9.4.3. Izolarea ADN/ARN/proteine utilizând TRIZOL 9.4.4. Detecţia acizilor nucleici utilizând spectroscopia de absorbţie 9.4.5. Detecţia ADN şi ARN cu bromură de etidium (analiza electroforetică în gel de agaroză) 9.5. Reacţia de amplificare polimerazică 9.5.1. Reguli pentru alegerea primerilor 9.5.2. Strategii de optimizare a eficienţei reacţiei de PCR 9.5.3. Verificarea amplificabilităţii ADN 9.5.4. Condiţiile utilizate pentru decelarea HPV utilizând PCR standard 9.5.5. Amplificarea ADN HPV utilizând reacţia Nested-PCR 9.5.6. Detecţia şi genotiparea HPV utilizând kitul INNO-LiPA 9.6. Utilizarea reacţiei de hibridizare 9.6.1. Obţinerea sondei HPV 9.6.2. Utilizarea Souther Blot pentru confirmare 9.6.3. Hibridizarea in situ 9.7. Reactia RT-PCR 9.8. Evaluarea expresiei markerilor fenotipici celulari utilizând imunohistochimia 9.9. Evaluarea expresiei markerilor fenotipici celulari utilizând tehnica citometriei de flux. 9.10. Determinarea concentraţiei de citokine (TNF-α α, IL-1β β, IL-2, IL4, IL-6, IL-8, IL-9, IL-12) în supernatantele culturilor de celule. 9.11. Iniţierea culturii de celule din piese bioptice 9.11.1. Obţinerea şi menţinerea culturii de celule 9.11.2. Coloraţia SA-β-Gal 9.12. Metode de decelare a modificărilor genice şi de analiză cromozomială 9.12.1. Decelarea mutaţiilor în gena k-ras prin tehnica MASA 9.12.2. Decelarea polimorfismului p53 9.12.3. Măsurarea cantităţii de ADN: Analiza ploidiei în culturi de celule şi probe biopsice prin citometrie în flux 9.12.4. Analiza cromozomială 9.12.4.1. Prepararea cromozomilor 9.12.4.2. Bandarea G 9.12.4.3. Caracterizarea generală a cromozomilor mitotici umani 9.13. Metode de analiză statistică REZULTATE Capitolul 10. STABILIREA UNOR MARKERI CELULARI/MOLECULARI ASOCIAŢI TRANSFORMĂRII CU HPV 10.1. Depistarea cancerului de col uterin (analiza citologică, colposcopică şi histologică) 10.1.1. Analiza citologică 10.1.2. Observarea colposcopică 10.1.3. Examenul histologic

88 88 90 92 92 99 102 106 107 107 110 110 111 113 115 119 119 120 121 123 124 125 126 126 127 128 129 130 132 133 133 135 136 140 143 145 146 146 146 147 147 148 149 151 151 152 153 155 156 156 157 163 167

2

10.1.4. Incidenţa leziunilor displazice severe sau cu severitate scăzută la populaţia analizată 10.2. Screening-ul virusologic molecular 10.3. Mutageneza inserţională prin integrarea genomului HPV - factor major în promovarea patogenezei cancerelor associate HPV. 10.3.1. Distribuţia infecţiilor HPV16 10.3.2. Decelarea integrării HPV16 prin PCR multiplex 10.4. p16INK4a marker în screening-ul persistenţei HPV? 10.4.1. Decelarea imunohistochimică a p16INK4a şi relaţia cu gradul CIN 10.4.2. Evaluarea modificărilor cantitative ale expresiei genei p16INK4a în dezvoltarea cancerelor cervicale scuamoase HPV induse. 10.5. Expresia hTERT ca potenţial marker de diagnostic 10.6. Expresia k-ras – marker al leziunilor displazice şi canceroase 10.6.1. Investigarea incidenţei mutaţiilor punctiforme ale genei K-ras în cancere associate infecţiei HPV 10.6.2. Evaluarea modificărilor cantitative ale expresiei genei k-ras în dezvoltarea cancerelor cervicale scuamoase HPV induse. 10.7. Corelaţiile între profilele de expresie ale celor trei gene analizate în leziunile preinvazive şi cancere (integrarea rezultatelor) Capitolul 11. POTENŢIALI MARKERI DE MONITORIZARE ÎN CANCERELE LARINGO-FARINGIENE 11.1. Depistarea cancerelor cu localizare laringo-faringiană 11.1.1. Evaluarea clinică a pacienţilor 11.1.2. Evidenţierea histologică a tumorii primare 11.2. Decelarea ADN/HPV în cancerele laringo-faringiene: 11.3. Virusul HPV-marker în adenopatii metastatice satelite cancerelor laringofaringiene 11.3.1. Evidenţierea histologică a adenopatiilor metastatice la pacienţi cu cancere cu localizare laringo-faringiană 11.3.2. Detecţia ADN HPV în adenopatiile metastatice satelite cancerelor laringo-faringiene. 11.4. Detecţia ADN HPV în circulaţia periferică la pacienţi cu cancere laringofaringiene. 11.5. Expresia citokinelor Th1/Th2 la pacienţi cu cancere ale căilor respiratorii. Argumente pentru creşterea aberaţiilor expresiei de citokine în stadiile avansate Capitolul 12. TV - MODEL DE STUDIU IN VITRO AL INFECŢIEI CU HPV 12.1. Iniţierea culturii de celule 12.2. Detecţia ADN HPV în cultura TV 12.3. Caracteristicile morfologice ale culturii TV 12.4. Analiza caracteristicilor de proliferare 12.5. Analiza citogenetică 12.6. Analiza conţinutului de ADN 12.7. Creşterea clonogenică: 12.8. Studiul unor markeri specifici diseminării tumorale 12.8.1. Determinarea concentraţiei de citokine în supernatantul de cultură 12.8.2. Expresia receptorului factorului de creştere epidermal (EGFR) 12.8.3. Expresia factorului de creştere al epiteliului vascular (VEGF) DISCUŢII CONCLUZII FINALE BIBLIOGRAFIE ABREVIERI COMUNICĂRI ŞI PUBLICAŢII ÎN CADRUL TEZEI

171 173 182 183 184 187 188 197 201 207 209 212 216 220 220 220 222 226 234 236 240 243 244 264 264 266 266 269 272 274 276 277 277 280 281 284 334 340 368 372

3