002_Curs 7

Dezvoltarea limfocitelor T si B (limfopoieza) Hematopoieza este initiata in sacul vitelin, dar, pe masura cc procesul de embriogeneza avanseaza, aceasta functie este preluata de catre ficatul fetal si, in final, de catre maduva hematopoietica. Limfocitele care vor rezulta in etapele precoce de viata intrauterina in tesuturi hematopoietice primitive sunt diferite de cele care deriva din maduva hematogena si vor migra la nivelul epiteliilor si mucoaselor. Astfel de celule limfoide, care vor reprezenta la organismul adult doar o minoritate, vor participa la raspunsurile sistemului imun innascut. Celulele stem hematopoietice care vor da nastere „elementelor figurate" ale sangelui sunt multipotente si au capacitatea de a „insamanta" alte organe. In plus, aceste celule au o capacitate practic nelimitata de a se auto-reinnoi, astfel ca un organism poate fi protejat impotriva efectelor letale ale iradierii prin injectarea de celule stem care vor repopula sistemele mieloid si limfoid. Totusi, capacitatea de autoreinnoire nu este absoluta si descreste odata cu varsta, in paralel cu o scurtare a telomerilor si o reducere a telomerazei (enzima care repara scurtarea cromosomilor — fenomen care altminteri s-ar produce dupa fiecare diviziune celulara), Celulele stem hematopoietice multipotente se vor diferenţia iniţial în celule stem mieloide şi celule stem limfoide. Acestea din urmă, fie vor fi reţinute la nivelul măduvei osoase şi se vor diferenţia în limfocite B, fie vor migra, datorită acţiunii unor factori chemotactici, la nivelul timusului şi se vor diferenţia în limfocite T. Măduva osoasă şi timusul sunt organele limfoide primare, la nivelul cărora este desăvârsita formarea majorităţii limfocitelor B şi respectiv T, până la stadiul in care acestea sunt mature şi functionale, deci exprimă si un receptor pentru antigen complet şi corect format. Producţia de limfocite T este mult diminuată la adult, în schimb limfocitele B sunt produse în continuu. Dezvoltarea limfocitelor T La început, timusul e doar un rudiment derivat din a 3-a şi a 4-a pungă faringeală. in a 6-a săptămână de sarcină, invazia celulelor dendritice, a macrofagelor şi a unor precursori T transformă această glandă într-un organ limfoid primar. Adevarata migraţie a progenitorilor celulelor T către timus va avea loc însă începând cu a 8-9-a săptămână de sarcină. Precursorii T suferă o maturaţie rapidă la nivelul timusului, care devine astfel locul celei mai intense activităţi mitotice din tot organismul. După 20 de săptămâni de sarcină, limfocitele T mature încep să migreze către organele limfoide secundare. În SCID (Severc Combined Immunodeficiency — imunodeficienţa severă combinată), timusul nu reuşeşte să devină un organ limfoid primar. Rolul timusului era necunoscut înainte de anul 1960, când Jacques Miller şi colaboratorii săi au observat, în cadrul unor experimente carc vizau virusuri cc induceau limfoame şi leucemii la şoareci, că timectomia conducea la infecţii generalizate şi la moartea animalelor, inclusiv ale celor din grupul de control. Simptome similare au fost ulterior descrise în cazul aşa numiţilor şoareci „nuzi". Aceştia prezintă o mutaţie autosomală recesivă nu/nu, responsabilă pentru blocarea dezvoltării foliculilor piloşi, dar şi pentru dezvoltarea timusului'. Nu în ultimul rând, importanţa timusului în imunitate a fost subliniată şi de sindromul DiGeorge, descris pentru prima oară in 1954, afecţiune în care s-a demonstrat că, printre alte malformaţii, timusul este hipoplazic sau chiar aplazic2. Diferentierea limfocitelor in timus se produce de-a lungul intregii vieti a unui individ, dar dimensiunea timusului scade la mamifer odata cu pubertatea (si astfel si limfopoieza limfocitelor T se reduce dramatic), probabil datorita sintezei de hormoni steroizi. Timusul este un organ retro-sternal bilobat, fiecare lob fiind la randul sau organizat intr-o serie de lobuli. Stroma timica este formata din celule epiteliale dendritice alcatuind o retea tri-dimensionala, iar ' Şoarecii nuzi prezintă o mutaţie a genei care codează pentru factorul de transcripţie Foxn 1, responsabil pentru dezvoltarea celulelor epiteliale dendritice corticale şi medulare. Aceasta mutatie este foarte rara la om si se asociaza, pe langa imunodeficienta, cu alopecie congenitala si distrofie a unghiilor. Sindromul sau boala DiGeorge apare ca urmare a unei deletii la nivelul CRS 22q11 si este caracterizat prin malformatii faciale, cardiace si endocrine, la care se adauga imunodeficienta generata de afectarea timica. 2

printre aceste celulele se gasesc limfocitele T in dezvoltare; astfel, timusul este un organ limfo epitelial. Fiecare lobul este constituit dintr-o regiune corticala si una medulara, separate prin asa numita jonctiune cortico-medulara. Celulele epiteliale dendritice din regiunea corticala si cele din regiunea medulara sunt diferite atat dpdv morfologic (lungime si latime a dendritelor) cat si dpdv al moleculelor sau cantitatii de molecule exprimate. Se remarca de asemenea ca celulele epiteliale ale medularei, celulele din regiunea subcapsulara si cele perivasculare prezinta molecule comune, distincte insa de moleculele exprimate de celulele epiteliale corticale. Jonctiunea cortico-medulara este in schimb populata cu celulele derivate din maduva hematogena, cum ar fi macrofagele „santinela" sau celulele dendritice interdigitate (celule prezentatoare de antigen), acestea din urma fiind de asemenea prezentc si in medulara. In regiunea externă a cortexului se găsesc aşa numitele „celule doică", celule de origine epitelială, care au capacitatea de prelua între prelungirile lor un număr de până la 50 de timocite, împreună cu care formează complexe multicelulare. in regiunea medulară se găsesc în schimb „corpusculii Hassal", formaţi, cel mai probabil, din aglomerarea celulelor epiteliale degcnerate. Natura distinctă a celor două compartimente, corticala şi medulara, este subliniată şi de atrofia selectivă indusă de un număr de factori: organotina acţionează primordial asupra celulelor T imature corticale; dioxina acţionează asupra unui rcceptor prezent pe suprafaţa celulelor epiteliale corticale, ciclosporina A determină atrofia elementelor medulare, blocând diferenţierea celulelor T corticale în celule T medulare; în schimb, prin producţia de 20a-hidroxil steroid dehidrogenază, limfocitele T medulare sunt relativ rezistente la acţiunea steroizilor. Interactiunea dintre celulele stromale timice si celulele T in formare este esentiala pentru dezvoltarea acestora din urma, dar aceasta interactiune este de asemenea vitala si pentru celulele epiteliale. Fibroblastele, a căror organizare tridimensională s-a dovedit de asemenea critică pentru dezvoltarea timocitelor, sintetizează produşi precum fibronectina, colagenul şi laminina. Aceştia sunt probabil responsabili pentru formarea unor structuri la nivelul cărora să se poată concentra factori solubili, dintre care se remarcă. interleukina-7 (IL-7). Există, de asemenea, interacţiuni subtile între proteinele matricii extracelulare şi o varietate de molecule de adeziune (integrine) prezente pe suprafaţa unor subpopulaţii de limfocite, molecule produse prin „matisare" (splicing) diferenţiata şi glicozilare posttranslaţională. O menţiune specială se adresează receptorilor Notch 1 de pe suprafaţa timocitelor, pentru care celulele stromale fumizează o serie de liganzi. Prin asocierea .directă cu o serie de factori transcripţionali, Notch 1 stimuleaza dezvoltarea limfocitelor T şi inhibă dezvoltarea limfocitelor B. Semnalizarea prin Notch induce expresia factorilor transcriptionali GATA-3 si TCF1 (T cell factor-1), fiecare dintre acestia fiind necesari pentru dezvoltarea limfocitelor. Astfel, TCF 1 si GATA-3 impreuna initiaza expresia CD3 si RAG-1. Cu toate acestea, TCF-1 si GATA-3 nu sunt suficiente si blocarea programelor de diferentiere alternativa necesita factorul transcriptional Bcl 1 lb. Dezvoltarea timică impune şi interacţiuni cu mediatori non-timici. Aceştia sunt reprezentaţi de citokine (interleukine, CSF-uri, IFNy). Rearanjă,rile genice intracelulare şi interacţiunile intercelulare din timpul proceselor de selecţie (procese ce vor fi descrise mai jos), acompaniate de moarte cclulară sau supravieţuire şi proliferare, sunt reglate atât de hormonii timici cât şi de interleukine. Pe lângă toate aceste elemente structurale, trebuie menţionată lamina bazală care separă spaţiile epiteliale şi perivasculare şi care este denumită bariera hemato-timică. Rolul ei critic este acela de împiedica pătrunderea macromoleculelor din exterior la nivelul stromei timice şi astfel de a preveni contactul dintre antigenele circulante şi limfocitele T imature. Timusul joaca si rol de glanda, celulele epiteliale fiind capabile de a sintetiza o serie de peptide (hormoni), care par sa joace un rol in diferentierea Ceiulelor T, in sensul stimularii aparitiei unor molecule pe suprafata acestora. Dintre acesti hormoni, patru au fost complet caracterizati, cunoscanduse inclusiv secventa lor: timulina, al timozina, 134 timozina .silimopoietina (si pentapeptidul sau activ TP-5). Dintre acestia, doar timopoietina si timulina au origine exclusiv timica. Timulina (un nonapeptid zinc-dependent) tinde, pe de o parte, sa norinalizeze balanta raspunsurilor imune prin restabilirea aviditatii anticorpilor si productiei de anticorpi la soarecii batrani, iar pe de alta parte stimuleaza activitatea supresorie la animalele cu anemie hemolitica autoimuna indusa cu ajutorul eritrocitelor cross-reactive de sobolan. Timulina poate fi astfel privita ca un adevarat hormon,

actionand la distanta de timus ca un adevarat imunoreglator fiziologic, care contribuie la mentinerea homeostaziei limfocitelor T. Timusul are o inter-relatie complexa cu sistemul nervos (inclusiv prin intermediul unei axe ce îl leagă direct de glanda pituitara), fiind foarte bogat inervat, atat cu fibre colinergice cat si adrenergice. In plus, celulele epiteliale medulare, celulele subcapsulare, perivasculare si celulele doica sunt capabile sa sintetizeze oxitocina, vasopresina si neurofizina. Stress-ul acut conduce la o scadere dramatica a numarului de celule T din cortex si la o crestere a numarului de celule epiteliale care exprima atat markeri corticali cat si medulari (probabil celule stem epiteliale intratimice). Distrugerea celulelor T corticale se datoreaza, cel putin partial, actiunii citolitice a steroizilor; limfocitele T medulare fiind, asa cum mentionam anterior, relativ rezistente la actiunea steroizilor ca urmare a 20a-hidroxil steroid dehidrogenazei. Evolutia timusului Timusul uman este pe deplin dezvoltat la nastere şi cântăreşte aproximativ 10 g. Există două curente de opinie, semnificativ diferite, referitoare la evoluţia timusului odată cu înaintarca în vârstă. După unii autori, la om, involuţia timică începe după primele 12 luni de viaţă, reducându-se cu cca. 3% pe an până la vârsta mijlocie şi cu cca. 1% pe an de aici incolo. După alţi autori, timusul urmeaza o perioadă de creştere continuă până la vârsta de 2 ani, când va atinge un platou şi va începe din nou să crească. între 7 şi 12 ani. La această vârstă, greutatea timusului se va fi dublat, căpătând totodată forma îngustă şi alungită cunoscută. incepând de la pubertate, va începe un proces de înlocuire progresivă a majorităţii spaţiilor perivasculare cu ţesut adipos şi fibros, astfel că în jurul vârstei de 50 de ani, grăsimea reprezintă mai mult de 80% din totalul volumului timic. Ca urmare, timusul îşi schimbă aspectul macroscopic şi dintr-o glandă de culoare gri-roz se transformă într-o masă gălbuie, care ar fi dificil de identificat în ansamblul grăsimii mediastinale fără ajutorul capsulei. După această vârstă, procesul de modificare continuă într-un ritm mult mai lent. Pierderea ţesutului glandular este descrisă ca „involuţie" şi conduce la păstrarea unui minimum de ţesut cortical şi medular. Dimensiunea organului nu este elocventă pentru acest fenomen, ca urmare a înlocuirii cu ţesut adipos. Diminuarea celularităţii se produce în special datorită faptului că timocitele dublu negative3 sunt împiedicate să mai prolifereze şi apoi să se diferenţieze, ceea ce are drept consecinţă (şi explică) scăderea diversităţii repertoriului TCR pe măsură ce organismul înaintează în vârstă. Ceea ce s-a putut dovedi experimental cu claritate a fost faptul ca involuţia timica nu se datorează influxului unui număr mai mic de progenitori ai limfocitelor T şi nici unui defect intrinsec al acestora. Procesul de involuţie este un proces controlat/reglat prin intermediul a numeroşi hormoni gonadali, corticosteroizi şi timici, precum şi a unui set de citokine. Experimental s-a putut demonstra ca involuţia timică nu este un proces intrinsec şi nici ireversibil, ci este rezultatul unor dereglări progresive ale interacţiunilor neuroendocrine-timice (inclusiv pe axa glanda pituitară-timus), ce apar odată cu inaintarea în vârstă. Dezvoltarea timusului şi îmbătrânirea sa sunt probabil influenţate de hormonul de creştere din glanda pituitară, care este controlată, la rândul ei, de hipotalamus. Semnalele pozitive iniţiale, recepţionate de la hipotalamus după naştere, se vor diminua odată cu înaintarea în vârstă, conducând la atrofierea timusului. Cel puţin teoretic, procesul ar putea fi reversat cu GH, TSH, T3, T4 şi LH-RH. Micromediul timic este semnificativ afectat de scăderea cu vârsta a nivelelor de IL2, IL-3 şi IL-7, această din urmă citokină fiind probabil implicată în stimularea expresiei bcl-2, necesară timocitelor care încearcă să producă primul lanţ al TCR-ului. Expresia altor citokine, precum LIF (leukemia inhibitory factor), IL-4, IL-5 sau IL-6, pare să crească odată cu înaintarea în vârstă. Timusul adult pare să deţină în continuare capacitatea de a contribui la producerea de limfocite T. Date recente arată că timusul funcţionează normal chiar şi în a şasea decadă de viaţă, după cum există dovezi chirurgicale care atestă absenţa unei involuţii complete a timusului chiar şi la bătrâni. În plus, este important de menţionat că timusul adult reţine capacitatea de a stimula recuperarea limfocitelor T după transplantul medular şi este responsabil pentru recuperarea acestora după chimioterapia oncologică sau anti-retrovirală administrată pacienţilor HIV-pozitivi. 3

Noţiunea de timocit dublu negativ va fi explicată în subcapitolul dedicat formării limfocitelor T.

Totuşi, timectomia la adult, spre deosebire de cea survenită la vârste mici, nu are urmări dramatice pentru sistemul imun. O ipoteză care a fost avansată în acest context se referă la posibilitatea ca în viaţa adultă alte organe limfoide să preia, cel puţin parţial, rolul timusului. O altă explicaţie se referă la mecanismul homeostatic prin intermediul căruia numărul de limfocite este menţinut în limite normale, chiar în absenţa timusului adult. Scăderea efluxului de limfocite T din timus le va obliga ca în periferie, atunci când răspund la antigen, să prolifereze mult mai mult, astfel că limfocitele cu memorie se vor afla aproape de limita lor replicativă.. La vârste înaintate, se constată însă ca această capacitatea de răspuns a limfocitelor T din circulaţia periferică este mai scăzută ca urmare a diferenţelor de expresic a unor varii molecule, transmiterii de semnale, producţiei de citokine etc. Formarea limfocitelor T

Outer corteet

Dezvoltarea LyT in timus este un proces complex, multistadial. Celulele stem limfoide migreaza din maduva osoasa in timus in a 8-a sau a 9-a saptamana a sarcinii. Precursorii T sufera o maturatie rapida la nivelul timusului, care devine astfel locul celei mai intense activitati mitotice din tot organismul. Dupa 20 de saptamani de sarcina, LyT mature incep sa migreze catre organele limfoide secundare. LyT in dezvoltare poarta numele de timocite. Ele se vor afla in contact permanent cu celulele epiteliale care formeaza stroma timica. Initial, celulele stem limfoide vor ajunge in sinusul subcapsular iar de aici isi vor incepe drumul care va strabate mai intai corticala apoi jonctiunea cortico-medulara si medulara.

La începutul formării lor, timocitele sunt denumite dublu negative (DN) deoarece nu exprimă nici una dintre moleculele co-receptor4. Precursorii celulelor T care ajung in timus necesita cca o saptamana de diferentiere pentru ca apoi, in cortexul extern, sa inceapa un proces de proliferare rapida. Initial, pe suprafata celulelor apar moleculele c-kit, care reprezinta receptorul pentru SCGF (stem cell growth I

t La rândul ei, etapa DN poate fi subîmparţită în DN i (c-kit+, CD44+, CD25-) — progenitori timici; DN2 (c-kit+, CD44+, CD25+) — pro-T (in aceasta etapa incep rearanjarile DJ pt TCR-(3); DN 3 c-kit-, CD44-, CD25+) — pre-T precoce (in aceasta etapa continua rearanjarile V-DJ, iar lanturile (3 exprimate se asociaza cu lantul pre-T-a); s — pre-T tardiv (in aceasta etapa, celulele prolifereaza). DN4 (c-kit-, CD44-, CD25-) 4

factor), apoi exprima CD44, o molecula de adeziune, iar apoi CD25 (lantul a al IL-2 R). Pe parcursul acestei perioade, celulele prolifereaza, dar genele TCR raman ne-rearanjate (celule pro-T). De asemenea, celulele exprima CD34 si este prezenta enzima TdT. Urmeaza expresia moleculelor CD2 si CD7, apoi sunt exprimate moleculele CD1, CD5 si CD3. Genele ţ3 si y incep sa se rearanjeze, mai mult sau mai putin simultan. Daca genele y sufera o reasortare productiva, incepe si rearanjarea genelor S. Daca atat genele pentru lanturile y cat si cele pentru lanturile 8 sunt rearanjate productiv, cu alte cuvinte transcriptia poate avea loc si are loc sinteza lanturilor, alte rearanjari nu vor mai avea loc si acele timocite vor ramane y8 si se vor dezvolta, pe o cale diferita, in celule DN, CD3+ TCR y8. Mai puţin de 5% dintre timocite ajung la rearanjări productive ale genelor TCR y şi 8 5 care să le permită să evolueze astfel încât să se formeze limfocite T y86. Apoi, celulele isi pierd expresia c-kit, expresia CD44 scade foarte mult si incep sa-si rearanjeze genele pentru TCR. Majoritatea timocitelor DN aleg insa o alta cale de dezvoltare. Daca rearanjarile y si/sau d nu sunt functionale, vor continua rearanjarile ţ3 Celulele se opresc din proliferare si incep sa-si rearanjeze mai intai genele DJ, simultan pe ambii CRS, apoi procesul de rearanjare V-DJ va continua, conform procesului de excluzie alelica, doar pe unul dintre cei doi CRS. Acele celule care nu reusesc sa ajunga la rearanjari productive vor muri. Celulele care reusesc insa, vor incepe productia acestui lant. Aceste timocite DN se numesc pre-T. Lantul I3 va fi asociat pe membrana cu o glicoproteina cu o GM de 33kDa, numit lant pre-Ta si, impreuna cu lantul (3 si molecula CD3 vor forma receptorul celulei pre-T (pre-TCR). Nu este inca foarte clar daca semnalul necesar pentru diferentierea in continuare a celulei provine din interactiunea pre-TCR cu liganzi necunoscuti sau daca simpla exprimare pe suprafata a acestui receptor surogat este suficienta. A doua ipoteza ramane favorita, dat fiind faptul ca lantul pTa conduce la dimerizarea pre-TCR in absenta unui ligand, iar consecinta ar fi un semnal transmis prin complexul CD3, care activeaza lck (o PTK). Transductia semnalului prin pre-TCR are cateva efecte. Odata ce celula a ajuns la o rearanjare TCRP productiva sunt suprimate alte reanjari ale lanturilor I3-TCR (componenta a fenomenului de excluzie alelica). Sunt astfel selectate acele timocite care exprima lantul f3 pentru o expandare si maturare ulterioara. Din acest moment pot fi declansate rearanjarile pentru lantul a. Totodata, incepe diferentierea catre stadiul Dublu Pozitiv (DP — CD4+ CD8+). Odata ce semnalul a fost transmis prin pre-TCR, rearanjarile 13 sunt stopate, moleculele CD4 si CD8 se exprima simultan si, ca urmare, celulele sunt denumite dublu pozitive (DP). Timocitele incep sa prolifereze din nou. In timpul acestei faze proliferative, rearanjarile pentru TCR a nu pot apare, desi atat genele RAG-1 si RAG-2 sunt active dpdv transcriptional. Rearanjarea a nu poate avea loc in aceasta etapa deoarece proteinele RAG-2 sunt degradate rapid in celulele care prolifereaza. Aceasta faza proliferativa contribuie la diversitatea limfocitelor T prin generarea de clone cu un singur lant f3 rearanjat. Ulterior, aceste lanturi (3 vor fi asociate cu diferite lanturi a. La un moment dat, proliferarea timocitelor DP se opreste si nivelul de RAG-2 creste. In acest moment, incep rearanjarile genelor a, iar acele timocite care vor ajunge la rearanjari productive vor fi capabile sa exprime pe suprafata un TCR af3 complet format, chiar daca la nivele scazute (TCR I°). Timocitele sunt in continuare DP si se gasesc la nivelul corticalei profunde. In acest stadiu de dezvoltare, expresia CD44 si CD25 s-a pierdut complet. De aici incolo, aceste celule vor suferi o serie de procese complexe, cunoscute sub numele de selectie pozitiva si negativa. Nu este clar daca timocitele y8+ sufera procese similare inainte de a parasi timusul.

Există un „silencer" TCRy, cu un rol esenţial în dezvoltarea limficitelor Taf3. Limfocitele Ty5 şi respectiv al3 se formează urmând căi de dezvoltare distincte. Majoritatea limfocitelor Ty5 vor părăsi timusul în stadiul DN. Cele care ajung în stadiul simplu pozitiv sunt CD8+. 5 6

Ikatos, Aiolos, PU.1. Ncktil

T hwn ile geţt erit or c-kr CD4 4+. CD2 5-

—›

70, RaeG RID, Vayl , Cak, 111Q Vilk. GADS, ld2, EFtK1

( RroT oell 0Mr, CD4 44. CD2 5*

T O R c O ' Early pnaT CD44-, CD25*

I P r e T C R o h e c a p o i n t Le » pr eT ckr, CD 44, CD 25TCRcx , CD4, CD36. MHC II, Irskot ent chaln. 112M. GrO2. CD45. ZAP-

c R e c k p oi n ţ

c-kit pTet,

TCF1a, C►9a

cDop, GATA, S, Jek9

p2m.

CD% TAP1, CD45. I RF-1. RAG1/2, TCRiţt4 pTct, D14A-RK Ic13, CD&,,iţţ Lcic, Jak2, Cak, E FK1, ZAR-70+SykLeki-Fyn, ZARIL-2Ry, IL-7Ra, TCF la, 70, FtsaG GATA-9, Rho. LAT, GADS FIP, Vawl,

GAD S, CitQ

(117;.\!

Hstpet T k)ell

Trwle eptedlon

T cell

Procesele de selectie Selectia pozitiva in acest stadiu de diferenţiere, celulele T vor începe să sufere procese denumite de „selecţie", rolul acestora fiind acela de a înlătura atat limfocitele care prezintă un TCR nefuncţional, in sensul că nu sunt capabile să recunoască moleculele MHC self, cât şi limfocitele care recunosc complexele MHC/peptid self. Soarta timocitelor este decisă de nivelul semnalului recepţionat, care, la rândul lui, este dat de forţa globală a interacţiunii (aviditate), la care contribuie nu doar receptorul pentru antigen ci şi un întreg set de molecule accesorii. O aviditate

moderată asigură disocierea în timp util a timocitelor, ceea ce împiedică asamblarea unui complex de semnalizare complet, dar asigură totuşi un nivel de semnalizare care să conducă la transcripţia de gene responsabile pentru salvarea şi inducerea proliferării celulelor respective. Este posibil de asemenea ca celulele epiteliale corticale să exprime şi un set de molecule accesorii responsabile pentru transmiterea şi/sau modelarea unui semnal necesar pentru supravieţuire. Acele timocite DP care recunosc şi leagă cu o forţă moderată moleculele MHC I sau II vor fi „selectate pozitiv". Astfel, procesul de selecţie pozitivă asigură „restricţia MHC", cu alte cuvinte, capacitatea TCR de a interacţiona doar cu molecule MHC self. Dacă însă receptorii timocitelor se leagă cu o aviditate crescută la complexele MHC/peptide şi rata de disociere este scazută, atunci va fi transmis un semnal puternic şi clonele

respective vor fi deletate prin apoptoză. Procesul de selectie pozitiva are loc la nivelul corticalei profunde si implica interactiuni ale timocitelor DP, TCR1° cu celulele epiteliale corticale. Consecinta acestui fenomen denumit restrictie MHC, va permite LyT sa recunoasca Agnele prezentate doar in contextul MHC-urilor self. Astfel, pentru restul vietii sale, un LyT (nu numai in timus, dar si in periferie) va raspunde la un Ag doar daca acesta este legat de tipul de molecula MHC pe care 1-a intalnit (in acest stadiu de dezvoltare) in timus. Numarul celulelor care poseda un receptor corespunzator din acest punct de vedere este mic si, ca urmare, o serie din celulele care nu au fost selectate pozitiv au posibilitatea sa isi reia rearanjarile

pentru lantul a. Daca noua rearanjare va fi productiva exista potentialul de a conduce la o noua specificitate. Acest fenomen este denumit „editare" iar timocitul caruia i se ofera aceasta sansa va trebui sa treaca din nou prin procesul de selectie pozitiva. Daca celula nu reuseste sa produca un TCR corespunzator, va muri prin apoptoza in decurs de 3-4 zile. Selectia pozitiva conduce din nou la proliferare, la expansiunea timocitelor DP, ca si 1a stoparea transcriptiei genelor RAG-1 si RAG-2, astfel incat si rearanjarile pentru TCR sunt oprite. Selecţia pozitivă reprezintă totodata şi un moment crucial de evoluţie a timocitelor, în sensul că acestea se vor diferenţia în celule simplu pozitive (SP). Maniera exactă în care se realizează, inhibarea expresici unuia dintre co-receptorii CD4 sau CD8 nu este cunoscută şi există mai multe modele care încearcă să explice acest fenomen. Modelul stochastic susţine că procesul de pierdere a moleculelor CD4 sau CD8 în cursul selecţiei este unul aleatoriu. in contrast, modelul instructiv susţine că dacă, de exemplu, TCR-ul leagă un peptid prezentat de o moleculă MHC I, este angajat şi co-receptorul CD8 care transmite un semnal responsabil pentru inhibarea expresiei CD4. Specificitatea TCR-urilor de pe suprafata timocitelor care au supravietuit selectiei pozitive este diversa. Unele TCR-uri au recunoscut MHC I, altele MHC II; in plus, unele sunt capabile sa recunoasca peptide self, prezentate in cupele acestor MHC-uri, altele nu. Pentru a impiedica patrunderea LyT cu potential autoreactiv in periferie, timocitele DP sufera un nou proces de selectie. Selectia negativa Acest proces are loc prin interactiunea timocitelor DP cu celulele de origine hematopoietica de la nivelul jonctiunii cortico-medulare: macrofage santinela, celule dendritice interdigitate si continua in medulara, sub influenta celulelor epiteliale. Un timocit care exprima TCR capabil sa recunoasca cu prea mare afinitate combinatia MHC-peptid (in timus toate peptidele din cupele MHC sunt self) este deletat prin apoptoza. Astfel, din aceste procese de selectie vor supravietui doar acele LyT care au o afinitate potrivita pentru MHC self si recunosc Ag care nu sunt self. Eliminarea prin procesul de selectie negativa a timocitelor care poarta receptori de mare afinitate pentru molecule MHC self singure sau pentru Ag self prezentate de MHC, conduce la toleranta fata de self. Deoarece procesul are loc in timus, este denumit toleranta centrala. Acest proces nu este perfect; va continua in periferie, dar aici vor fi implicate mai degraba alte mecanisme decat inducerea apoptozei celulelor. Totuşi, nu este încă elucidat pe deplin mecanismul prin care o gamă uriaşă de peptide din întregul organism ajung să se cantoneze într-un organ destul de izolat ca timusul, care nu este nici macar conectat la circulaţia limfatică. Este foarte probabil ca celulele prezentatoare de antigen de la nivelul joncţiunii cortico-medulare şi medularei să transporte astfel de structuri la nivelul timusului. Alte structuri, cum sunt citokeratinele şi mielina sunt exprimate la nivelul celulelor care formează stroma organului. in plus, la nivelul medularei, a fost identificat un grup de celule epiteliale care pot exprima, de o maniera tranzitorie, molecule specifice unor diverse ţesuturi. A fost identificat ARN-ul care codează pentru o serie de molecule membranare şi secretate (inclusiv hormoni), factori de transcripţie etc. in exprimarea acestora pare să fie implicat un factor transcripţional numit AIRE (autoimmune regulator).

Timocitele SP sunt reţinute câteva zile în medulară, unde primesc un semnal ce induce o nouă proliferare. Totodată, celulele ajung la deplina maturitate şi astfel vor putea fi exportate în periferie ca limfocite mature, naive, în stadiul G o al ciclului celular. Acestea se vor indrepta catre organele limfoide secundare, unde vor popula ariile T-dependente. Din timus vor pleca valuri succesive de limfocite T, într-un ritm care este mult mai alert la vârste tinere, procesul menţinându-se însă şi la vârsta adultă, când, la nivelul timusului pot fi identificate în continuare timocite aflate în toate stadiile de dezvoltare.

N EGLECT

DEA11-1

insufficient ' t TCR signaţing X

Insufficient TCR signaling

POSMVE SELECTION CD4

SURVPIAL

Weak TCR signaling

Weak TCR signaling

NEGATIVE SELECTION CD4

DEATH

TCFi eignalhg

Strcrig TCR signaling

Limfocitele T y8 —5% dintre limfocitele T folosesc receptorul y8. Oarecum surprinzător, par să reprezinte populaţia majoritară de limfocite T din piele, epiteliul intestinal şi epiteliul pulmonar. În piele reprezintă —I% din totalul celulelor; aceste celule sunt denumite limfocite intraepidermale. Sunt CD4-CD8- (DN). Celulele y8 din epiteliul intestinal şi pulmonar sunt denumite intraepiteliale. Sunt CD8+. Spre deosebire de celulele af3, cele y8 nu par să fie recirculate şi rămân fixate în ţesuturi. Analiza receptorilor a demonstrat că un număr limitat de gene sunt folosite, iar diversitatea joncţională şi regiunea N sunt absente. S-a demonstrat că celulele y8 sunt capabile să se lege direct de un herpes-virus, fără să fie nevoie de procesare şi prezentare, deci intr-o manieră MHC ne-restrictată; de asemenea, se leagă de antigene nepeptidice de pe suprafaţa micobacteriilor şi la PPD (Purified Peptide Derivative), manieră asemănătoare anticorpilor. Celulele y8 pot liza o serie de celule tumorale manieră MHC ne-restrictată. PPD prezintă o secvenţă similară cu cea a proteinelor de şoc termic ale mamiferelor (proteinele de şoc termic sunt componente normale ale matricei mitocondriale). Aceasta sugerează că celulele y8 ar putea avea rolul de a elimina celulele self deteriorate, dar şi microbi. Localizarea particulară a celulelor y8 în epitelii sugerează că sunt destinate să răspundă unor antigene epidermice sau intestinale şi formează astfel un sistem de supraveghere la acest nivel.

Ontogenia limfocitelor B Generarea limfocitelor B apare la nivelul embrionului, dupa care va continua intreaga viata. Inainte de nastere, sacul vitelin, ficatul fetal si maduva osoasa fetala sunt situsurile majore de maturare; dupa nastere, generarea LyB mature apare doar in maduva osoasa. Dezvoltarea LyB incepe de la stadiul de celula stem limfoida, iar primul stadiu care marcheaza orientarea catre lineajul B este numit pro-B. Pro-B prolifereaza in maduva osoasa, umpland spatiile extravasculare dintre sinusoidele mari ale osului. In acest stadiu, exprima molecula CD45R, o tirozin fosfataza si molecula CD44. Aceasta din urma interactioneaza cu acidul hialuronic de pe suprafata celulei stromale, ceea ce va promova in continuare interactiunea dintre c-kit (o tirozin kinaza de pe suprafata celulei pro-B, modulata de CD45) si SCF (stem cell factor) de pe celulele stromale. Stadiul pro-B poate fi divizat in doua etape: pro-B precoce si pro-B tardiv. Una dintre moleculcle cheie pe care LyB in formare trebuie sa o exprime este receptorul pentru Ag. Primul lant pe care celula incearca sa il exprime este lantul greu, iar procesul incepe de la nivelul partii variabile. Astfel, incep rearanjari DJ simultane pe ambii CRS 14. Genele si enzimele RAG1 si RAG2 sunt active, ca si enzima TdT. In stadiul pro-B tardiv, ca urmare a fenomenului de excluzie alelica, urmatoarea rearanjare are loc doar pe unul dintre cei doi CRS. Daca aceasta prima rearanjare este neproductiva, procesul continua pe CRS pereche. De asemenea, in acest stadiu, consecinta a interactiunii dintre c-kit si SCF, semnalul declansat de activitatea de tirozin kinaza a c-kit stimuleaza celulele pro-B sa exprime IL-7R. IL-7 eliberata de celulele stromale induce maturarea celulelor pro-B in celule pre-B. Urmatorul stadiu, Pre-B, marcheaza asocierea primei gene constante, Cg, la segmentul genic rezultat din fuziunea VDJ. Odata ce acest proces are loc, procesul de translatie nu intarzie sa apara. Sinteza lanturilor j_t va permite identificarea acestora in citoplasma. Totodata, o cantitate redusa de lanturi µ va fi exprimata pe suprafata, asociate cu un lant L surogat, format din doua segmente, denumite V pre-B si respectiv 9ţ5. Asamblarea a doua lanturi µ si a doua lanturi V pre-B/X5 conduce la formarea asa numitului receptor al celulei pre-B. Acest receptor va fi asociat cu moleculele Igoc (CD79a) si IgI3 (CD79b), care sunt legate printr-o legatura S-S una de cealalta. Impreuna cu g/V pre-B, 2k..5 formeaza asa numitul pre-BCR. Igcc si Ig13 nu sunt implicate in legarea Ag-nului, ci a un rol in transmiterea semnalului in interiorul celulei dupa legarea Ag-nului la nivelul paratopului. De aceea, Igcc si Ig13 sunt denumite molecule de transductie a semnalului. In timpul etapelor precoce de dezvoltare ale celulelor B, acele celule care nu reusesc sa exprime preBCR (deoarece nu reusesc sa isi rearanjeze de o maniera productiva genele pentru lanturile grele sau pentru alte motive) mor prin apoptoza. Celulele care exprima insa pre-BCR vor suferi in continuare un proces denumit „selectie pozitiva", mediat de semnale transmise prin pre-BCR. Nu este inca foarte clar daca acest receptor intermediar trebuie sa lege liganizi sau doar simpla expresie a receptorului conduce la diferentierea in continuare a celulelor B. In stadiul pre-B, rearanjarile VDJ sunt stopate si, din acest moment, incep rearanjarile pentru lanturile usoare. Prima optiune a celulei este reprezentata de lantul L k. Doar daca rearanjarile pentru lantul k sunt ne-productive celula incearca rearanjari V-J pentru lantul principiul excluziei alelice fiind respectat si in acest caz. De asemenea, TdT isi inceteaza activitatea. Celulele B imature. In urmatorul stadiu de diferentiere, lanturile usoare sunt acum asamblate cu lanturile grele µ si IgM monomerica poate fi acum formata si exprimata pe membrana celulara. O serie de experimente au aratat ca LyB imature pot recunoaste si lega Ag, dar aceasta legare conduce la o inactivare de lunga durata si nu la expansiune si diferentiere. S-a aratat de asemenea ca LyB imature pot interactiona cu moleculele self din maduva osoasa, ceea ce din nou va conduce la inactivare. Aceasta particularitate de interactiune este foarte importanta pentru dezvoltarea tolerantei la self in lineajul celulelor B. Daca un LyB imatur este expus la o molecula self exprimata pe suprafata celulelor din stroma medulara, limfocitele vor muri prin apoptoza (deletie). Daca insa LyB imature leaga Ag solubile, celulele sunt inactivate, dar nu deletate (sunt anergizate). Inactivarea LyB imature autoreactive se numeste „selectie negativa".

Exista insa si o a treia posibilitate, oarecum neasteptata si anume aceea de a apela la noi rearanjari, prin utilizarea genelor ramase. Fenomenul este denumit „editare" si poate conduce la o noua specificitate care sa „salveze" LyB imature de la inactivare. Celulele B mature. Ultimul stadiu de dezvoltare este limfocitul B matur. Acest stadiu apare predominant in maduva osoasa, dar poate sa se produca si in organe limfoide secundare. Caracteristica acestei etape este co-expresia de IgM si IgD, lucru posibil ca urmare a unei modificari in procesarea ARN-ului care apare la nivelul transcriptului primar, ceea ce va permite productia a doua mARN, una codand pentru forma membranara a lantului µ si cealalta pentru forma membranara a lantului 8. Semnalele care conduc la diferentierea celulelor IgM pozitive la celulele IgM+, IgD+ nu sunt cunoscute. EXPRESSEI)

—

Non

Exp rr,Ni 7511 of 112215 Pro-B cell I Hr;11.-

Prr-BtirtII1

Flonv marmv,'

NOIlt

■,•-cluin

re,irrangc•mrnt

,11311,

light-clum genţ- re,irr,mgrmen

innuture Il •ell

I

HC.INŢ c'ămin

+ Nurnvizate light yluin

ILD

4*

t tlianw,.. iii ItNA prix:4,:ir.44

11ir 4

nilgt)

=Ninurul'N c•il 3

`—'"‹..'

Pattige-fi stimulation 3- -..

AcţivAILNI11erli tkriphunil mphoi.d organs

111,& ,

41wo;

....

z .

ul,.:11ii)g and ditYcrviltiatikin

*111 4. 1 ,,

",

PLisma celis

-

)

Menhir• fi crils

- "\,,

Hostl• NeurcIeţl. 42, >f v;iril>us

I ..,' .._

ntig tf •JTICFLLS ii>.utTpts

Multi factori transcriptionali actioneaza in timpul dezvoltarii celulelor hematopoietice. Pana in prezent, au fost identificati cel putin 12 care joaca un rol in dezoltarea celulelor B: E2A, EBF (early B cell factor), BSAP (B cell specific activator protein), Sox-4. Soarecii care nu au E2A nu pot exprima RAG-1 si nu pot produce rearanjari DJ, dar nu pot exprima nici Â5. Toti acesti factori transcriptionali ar putea juca un rol nu numai in dezvoltarea celulelor B in fazele precoce, dar ar putea juca roluri esentiale in chiar orientarea catre lineajul B. Daca gena Pax-5 este facuta KO (gena al carei produs este factorul de transcriptie BSAP) se ajunge la blocarea dezvoltarii celulelor B. Situsurile de legare ale BSAP se gasesc la nivelul promoter-ilor unor gene caracteristice ale limfocitelor B, inclusiv V pre-B si  5 si la nivelul „enhancer-ilor" genelor constante. Aceasta arata ca BSAP joaca un rol si dincolo de stadiile precoce de dezvoltare. Acest factor este exprimat si la nivelul sistemului nervos central, iar absenta sa duce la defecte severe de dezvoltare a creierului. Desi situsul exact de actiune al Sox-4 nu este cunoscut, acest factor afecteaza stadiile precoce.

huaţ, rearningement p altele .2

and induers

p+

inbribit

reatrAngement af tc alirte .2 and rturrangemenT

K . trangernent -

lg ___________________________________________________ + tr ChaillS inhibit reanangement

u + chalris intlark reanuRgement (\‘.

allete *2

NottprimikiLlirc... dirle

Prodtwt Lve altele *2

f -

-

Producti•e allele .1

NtinpriKliklive Arle

,

N‹1141Y1}1,11.10iNC

aildC Nonproductive ailele 41' 1 N41 , nproducti•e

:

4111ele .2

Celulele B-1 si B-2 Exista un subset de celule B, numit B-1 care apar in ontogenie inaintea celulelor B-2, grupul major de limfocite B la om si la soarece. LyB-1 apar in cursul dezvoltarii fetale, exprima IgM, dar aproape deloc IgD si se remarca prin prezenta pe suprafata a moleculei CD5. Aceasta nu este indispensabila pentru dezvoltarea LyB si reprezinta mai degraba un marker al LyTh. Celulele B-1 se gasesc in cantitati foarte mici in majoritatea organelor limfoide, fiind localizate cu predilectie in cavitatea peritoneala si pleurala. Desi nu cunoastem totul despre aceste celule, exista o serie de caracteristici care le deosebesc de setul major de LyB. Daca in cursul vietii fetale celulele B-1 se dezvolta din celulele stem limfoide, la nivelul maduvei osoase, in viata postnatala aceasta populatie se reinnoieste prin proliferarea extramedulara a unora dintre ele.

Populatia B-1 raspunde destul de prost la Ag proteice, dar mult mai bine la carbohidrati. Prezinta pe suprafata IgM, dar celulele nu sufera hipermutatii somatice si nici comutari de clasa. Ca urmare, Ac-ii produsi de aceste celule sunt de mica afinitate si nu sunt totdeauna capabili de o stricta specificitate (polispecifici). Repertoriul lor restrans le permite sa faca fata unui numar redus de patogeni, cu care organismul se intalneste mai frecvent in viata precoce. LyB CD5+ nu necesita ajutorul LyTh si sunt responsabile, in buna masura, pentru nivelul de IgM din serul normal. De asemenea, se pare, aceste celule sunt responsabile pentru producerea asa numitilor „Ac naturali", descrisi de Niels Jerne in teoria sa (Teoria Selectiei Naturale). O parte din acesti Ac naturali joaca un rol important in formarea retelei Id-anti Id in absenta Ag-nului. Datorita polispecificitatii lor, o parte dintre ei sunt capabili sa se lege la structuri self, fara sa antreneze distructia acestora, ci din contra, ajutand, se pare, la mentinerea imaginii self-ului. Pe de alta parte, foarte multe din leucemiile limfocitice cronice (CLL) apar din acest subset.