001_Curs 6

MECANISMELE GENETICE CARE STAU LA BAZA GENER ĂRII DIVERSITĂŢII IMUNOGLOBULINELOR Receptorul pentru antigen aI limfocitului B este molecula de imunoglobulină (Ig). Studiile enzimatice efectuate in anii '60 au condus 1a elucidarea structurii sale, formată din două lanţuri grele (H — de la Heavy) identice şi două lanţuri uşoare identice (L— de la Light). incă de pe atunci devenise evident că cele două capete ale acestei glicoproteine posedă funcţii diferite. Recunoaşterea antigenului este efectuată cu ajutorul capătului amino-terminal, în timp ce capătul carboxi-terrninal este implicat în ceea ce denurnim funcţii "biologice". Lanţurile au fost impărţite ca atare într-o porţiune variabila (N-terminală) şi o porţiune constantil (C-terminală). Fiecare moleculă de imunoglobulină posedă două situsuri identice de legare a antigenului, iar la formarea fiecăruia participă atât partea variabilă a lanţului L cât şi partea variabilă a lanţului H. Astăzi ştim că porţiunea din imunoglobulină dedicată legării antigenului, numită paratop, este extrem de redusă ca dirnensiuni, fiind alcătuită din doar câţiva aminoacizi, localizaţi in aşa numitele regiuni hipervariabile. Nici antigenul nu participă la legare in intregul său, ci cu o porţiune corespunzătoare din punct de vedere dimensional, numită epitop. Adâncirea studiilor de structură a relevat organizarea moleculei în domenii "globulare", formate din câte două straturi opuse, unite prin intermediul unei legături disulfidice intra-lanţ şi a unei legături hidrofobe. Fiecare dintre straturi este format dintr-un număr de foi pliate, antipara1ele, unite prin bucle de conexiune. Totodată, analiza comparativă a unui număr mare de lanţuri a evidenţiat că diferenţele dintre acestea nu se regăsesc dispuse aleator în structura primară a proteinei ci sunt restrânse la nivelul câtorva porţiuni înguste, numite regiuni hipervariabile. La nivelul domeniului globular, regiunile hipervariabile se regăsesc în regiunea buclelor de conexiune dintre foile j3 pliatel. Fiecare limfocit B posedă pe suprafaţa sa imunoglobuline cu o specificitate unică, astfel că fiecare Iimfocit B este capabil să răspundâ unui epitop unic. Acest aspect a fost inţeles şi acceptat odată cu teoria selecţiei clonale. Antigenele pătrunse în organism vor selecta acele clone de limfocite care au specificităţile potrivite, le vor activa şi vor induce proliferarea lor. 0 parte din aceste limfocite se vor diferenţia în plasmocite, celule care nu mai exprimă imunoglobuline pe suprafaţă deoarece sintetizează lanţuri grele mai scurte şi sunt astfel incapabile de a mai insera aceste molecule membrană. in schimb, plasmocitele vor secreta imunoglobulinele, iar această variantă solubilă a receptorului pentru antigen al limfocitului B capătă numele de anticorp. Anticorpii sunt şi ei capabili să recunoască antigenele in mod specific, conducând la formarea de complexe antigen-anticorp (complexe imune). Imunoglobulinele reprezintă componentul central al receptorului pentru antigen aI limfocitului B (BCR — B cell receptor), căruia i se alătură moleculele constante Iga şi IgP, cu rol in transmiterea intracelulară a semnalului interceptat de receptor. Se estimează că sistemul imun a1 mamiferelor este capabil să sintetizeze mai mult de 101° imunoglobuline (anticorpi) diferite 2, un număr imens de molecule, care depăşeşte cu mult numărul de gene pe care genomul urnan îl poate pune la dispoziţie. Se pune firesc intrebarea: cum este posibilă sinteza numărului imens de imunoglobuline. 0 primă teorie (germ line theory teoria 1iniei germinale) estima că doar aproximativ 15% dintre genele unui genom haploid sunt alocate codificării imunoglobulinelor, fără să poată oferi însă nici o explicaţie pentru modalitatea de a forma, cu un număr limitat de gene, un număr atât de mare de -

Existenţa regiunilor hipervariabile a fost pusâ în evidenţă de câtre Wu şi Kabat în diagramele care le poartă. numele. Analiza regiunilor variabile a relevat că, din punct de vedere al structurii primare, diferenţele dintre lanţuri se regâsesc la nivelul unor porţiuni inguste, denumite CDR (complementarity determining region), în timp ce, în afara acestora (regiuni cadru), diferenţele dintre lanţuri nu sunt nici pe departe la fel de marcate. Totalitatea specităcitâ.ţilor diferite pe care le poate produce sistemul imun este cunoscută sub numele de Repertoriu Inumologie. 1

2

structuri diferite. Alte teorii ulterioare (somatic variation theories teoriile variatiei somatice) sustineau că, într-adevăr, din totalul genelor din genom, doar un număr limitat erau dedicate imunoglobulinelor, dar că, prin recombinări şi mutaţii, acestea erau capabile să ducă la diversitate. Din păcate însă, nici aceste teorii nu au reuşit să răspundă la intrebarea ridicată de studiile structurale, care au evidentiat. că moleculele de anticorpi manifestă nu numai diversitate la capâtul N-terminal dar şi constantă către capătul C-terminal. Astfel, a apărut pentru prima oară (Dreyer şi Benett, 1965) ideea că există gene separate pentru regiunea variabilă respectiv regiunea constantă, iar aceste gene reuşesc să se unească la nivelul ADN-ului pentru a forma o secvenţă continuă. Mai mult decât atât, intuitia celor doi se apropie foarte mult de realitatea cunoscută astăzi şi anume că pentru partea variabilă există disponibile sute de gene, în timp ce pentru partea constantă e necesară doar una. Au trebuit sâ treacă însă mai bine de 10 ani pentru ca progresul tehnologic să poată evidentia (Susumu Tonegawa, 1976) existenţa unor gene separate pentru regiunea variabilă şi constantă, ca şi rearanjarea genelor in cursul diferentierii limfocitelor B. Pe măsură ce a devenit posibilă clonarea şi secvenţierea genelor, s-a dovedit că procesul este şi mai complex. —

1. FORMAREA LANŢURILOR UŞOARE Imunoglobulinele pot utiliza două tipuri de lanturi L, denumite kappa (k) şi respectiv lambda (X) in fu.nctie de partea constantă. Partea constantâ şi partea variabilă a lanţurilor uşoare sunt aproximativ egale din punct de vedere al dimensiunii. 0 moleculă de imunoglobulină poate folosi fie lanturi k, fie lanturi (dar nu ambele simultan), fără ca aceasta să afecteze in vreun fel functionalitatea receptorului sau a anticorpului. Fiecare dintre cele două lanţuri uşoare este codificat de gene distincte, situate pe cromosomi diferiti: setul de gene care codifică lantul k se găseşte situat pe cromosomul 2 iar genele lantului uşor se găsesc situate pe cromosomul 22. Prima optiune a limfocitului B este reprezentată intotdeauna de lanţul uşor k. Partea variabilă a lanţului k (incepând de la capătul N-terminal) are o lungime de 108 aminoacizi şi este codificată de două segmente genice distincte: segmentul genic V (variabilă) codifică primii 95 de aminoacizi şi segmentul genic J (joining unire) codifică aminoacizii 96-108.  Analiza genică a relevat că în genomul celulelor germinale umane există aproximativ 75 de segmente genice Vk diftrăte, fiecare dintre ele putând codifica pentru un segment initial distinct al domeniului variabil k. Aceste gene variabile sunt aranjate în mod liniar, separate prin introni şi precedate (in plus fatâ de promotori) de o secvenţă exonică denumită Leader (conducătoare), situată în aval fată de promotor şi care va codifica un scurt peptid care are rolul de a introduce şi ghida lanţul ce se sintetizează în reticulul endoplasmatic. Acest peptid Ieader va fi însă clivat de la nivelul lantului sintetizat, înainte să aibă loc asamblarea lanţurilor uşoare şi grele.  La o oarecare distantă de grupul genelor V, spre capătul telomeric al ADN-ului, se găseşte grupul celor 6 segmente genice Jk, după care, separată printr-un intron foarte lung, se găseşte singura genă pentru regiunea constantă Ck, care codifică întreaga porţiune constantă a lantului k. Formarea lantului k începe prin aducerea unui segment genic Vk şi a unui segment genic Jk in imediata vecinătate unul faţă de celalalt, fenomen numit rearanjare genică. Genele sunt rearanjate şi unite datorită existenţei la cele două capete a unor secvente intronice denumite RSS (Recombination Signal Sequences secvente semnal de recombinare). Procesul este mediat de enzimele codificate de genele RAG-1 şi RAG-2 (recombination activation genes gene de activare a recombinării). Aceste enzime acţionează exclusiv la nivelul limfocitelor, iar prezenta lor simultană este indispensabilă pentru buna funcţionare a procesului. —

—

—

(a) Nucleotide sequence of RSSs

1

CACAGT G 23 bp ACAAAAACC GTGTCAC

23 bp TGTTTTTGG

Heptamer

Nonamer

GGT1"1"1 4TGT—

12 bp—CACTGTG

CCAAAAACA—

12 bp—GTGACAC

Nonamer

Heptamer

Tw(›turn RSS One-turn RSS În cursul procesului de rearanjare, cele două segmente genice V şi J, alese în mod complet aleatoriu, vor fi unite, dând naştere unei secvenţe genice continue; totodată, intregul material genetic care se gâsea intre cele două gene va fi excizat şi indepărtat. Astfel, ADN-ul limfocitului B care a suferit o rearanjare a genelor lanţului k va conţine următoarele regiuni, începând dinspre centromer către telomer: toate segmentele genice Vk de dinaintea celei selectate, promotor-ul şi exonul Leader (L) al segmentului genic Vk ales, un intron, segmentul genic continuu VkJk urmat de segmentele genice Jk neselectate, un intron şi gena pentru regiunea constantă. Secvenţa rearanjată a lanţului uşor este apoi transcrisă de către o ARN-polimerază, incepând de la segmentul L pânâ la semnalul stop de după gena pentru regiunea constantă, generând astfel un transcript ARN primar. Urmează apoi un proces de tăiere (matisare) a ARNm precursor, prin care sunt indepărtate secvenţele necodante şi un proces de poliadenilare a genei constante. Rezultă astfel ARNm matur care va pârâsi nucleul şi se va lega ulterior la nive1u1 ribosomilor. Aici are loc translaţia şi proteina ce se sintetizează va fi dirijată, de câtre segmentul Leader de la nivelul capătului N-terminal, in interiorul lumenului reticulului endoplasmatic rugos (RER). in RER, secvenţa Leader este îndepărtată iar lanţul uşor va putea, abia acum, să se asocieze cu un lanţ greu. Ogk Geirmline DNA ţ/K1

1/).2

Vr.:3

Nhai

1►1

JK2

J

Jtâ

JK4

Cx

'ffl=111111====r_ ea frann e f e n t

YxJK Rearranged DNA 5,

VKi

V►2

VK3 JK2

J

1),. JK4

G

Traneenprion Primaty RNA Tranaoript V►1

N/K2

V1,3 JK2

Jx4 Splicing

mRNA

V.K3JK2CK Transfaiion 01

4 9L, K Protein

C

K

k

r

3

1

:

1

Genele lanţului uşor se găsesc situate la om pe cromosomul 22. Locusul uman conţine aproximativ 75 de segmente genice şi 4 segmente genice despre care se ştie că sunt funcţionale (pe lângă altele nefuncţionale, numite pseudogene). Organizarea locusului  este diferită de cea pentru k, fiecare segment genic JÂ, fiind asociat cu câte un segment genic Ca. distinct. Sinteza lanţului  este similară in principiu cu cea a lanţului k: printr-o rearanjare aleatorie, mediată de RAG1 şi RAG2, un segment genic Va. (care codifică primii 97 de aminoacizi) este unit cu o un segment genic Ja„ (care codifică următorii 13 aminoacizi ai regiunii variabile), dar ADN-ul rearanjat va utiliza mai departe acea genâ Ca. asociată segmentului genic J ales.

::{~~~ VA2

V2.3

Ji.2

CX2

igl Germllne DNA G Vt,1

J

J?..3

C1.3

Jkl

C).1

3'

V

Rearrangement

V;u1;.. Rearranged DNA V)..2

V›.3

5*

''IMM

..1h2

=11

ak.2

C^Al 3'

=

1

-=

~ 111~:Y__■ 1.2.2 ~111 =

Transurphon

PrImary RNA TranscrIpt VĂ1 g».1

CA.1

3' _

Splicing

mRNA

Translation isaleffikel

i. Protein

2. FORMAREA LANŢURILOR GRELE Genele lanţului greu (H) sunt situate la om situate pe cromosomul 14. Organizarea acestor gene este mai complexâ decât cea a genelor ce codifică lanţurile uşoare (L) deoarece există un segment genic suplimentar D, care codifică o porţiune a regiunii variabile. Astfel, segmentul genic VH (cu o lungime de aprox. 300 baze azotate) codifică primii 94 de aminoacizi iar segmentul genic JH (cu o lungime de aprox. 30-40 de baze azotate) secvenţa curprinsă intre aminoacizii 98-113; secvenţa intermediară, extrem de scurtă (95-97), este codificată de un segment genic denumit DH (Diversitate) (cu o lungime de aprox. 9-23 de baze azotate). Prin secvenţializarea directâ a genelor de pe cromosomul 14, astăzi ştim că există, începând de la telomer spre centromer, un grup de 130 de segmente genice VH, urmate de un grup de 27 de segmente genice DH, apoi, la o oarecare distanţă, 6 segmente genice JH funcţionale.

Nueber ol Gene Segments• Gernifine G*ne Segrnerns

lierry Chae

t.01 Cha

HOUS£

I[APPă 111i-200

250 —31):.

15

4

75

'Hvribrrs n prenth eses are

75

num krs cF these gerţe xgrfxrrt that sre pseu dcleres.

0 altă caracteristicâ ce particularizeazâ genele lanţurilor grele este prezenţa în genomul celulelor germinale a unor gene multipk ce codifică regiunea constanrd. Partea constantă a lanţului greu este responsabilă pentru conferirea aşa numitelor funcţii "biologice" ale anticorpilor, iar conservarea acestor importante funcţii efectorii este realizată prin menţinerea unui număr limitat de gene pentru regiunea constantă. Human19/1Locua

VH1 L1

--ţ

n-120

vH2

5'

VHn

Ln =

L2

l e 1 1 1 1 1 1 1 1

i

Cu

C3

CIG

JN 1

DH1 DH2 D Fri-27

.51411. • 1 ~ 1 1 ~ 3 1 5 Ce2

Ca1

~

Ci

6

JI42 =

J14

4#5

JH4

s'

, 3 1 U ~

1

C12

Ci4

CeI

Ca2

H u man itgk Lcc us

n-75 V K1

5.

JK2

V W2

.1.41

Jioţ

-14

C K

5'

---

L1

Huntan

L2

1J1

Locue V742 Ll

L2

n-73 V"An

C24.1

-~11 :

Ln

_______ _

Elle

V aegrrfflt& D soggunts

J›.2

0.4

1

C.1.2

.:g5i:3[_ C›.5

J2■6

.1;.3

ffi

■"35Mr C;k8

9' C;k7

45 tp 4 bp

J sio3ntsnts C ziegrnents

C73

Pa If CK9•20.3

L138,1E4 5.quonc:»3 i"L)

1_____1 I pacer co.tip

Spre deosebire de partea constantâ a lanţurilor uşoare, regiunea situată spre capătul Cterminal a lanţurilor grele este cea care hotărăşte incadrarea întregii imunoglobuline intr-una din cele 5 clase (isotip)3. Grupul genelor CH (fiecare dintre ele flancate de introni) este separat de genele JH printr-un intron lung. in plus, fiecare genâ CH este formată din mai mulţi exoni şi introni. Fiecare dintre exoni codificâ câte un domeniu distinct al regiunii constante. Genele regiunii Partea constantâ a lanţului greu, codificatâ de o anumită genă constantâ, permite încadrarea întregii imunoglobuline într-una din cele 5 clase (isotipuri): A, D, E, G, M. De fapt, există 9 tipuri distincte de lanţuri grele, ceea ce permite distincţia unor clase şi subclase: IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA], IgA2, IgM, IgD, IgE. 3

5 -

constante sunt aranjate într-o anumitâ ordine, iar acest aranjament secvenţial nu este intâmplâtor, fiind în directâ legăturâ cu ordinea exprimării claselor de imunoglobuline în cursul diferenţierii limfocitului B şi a râspunsului initial în IgM la contactul cu un antigen. Pentru a genera o genă transcriptibilă pentru lantul greu sunt necesare rearanjări distincte. in aceeaşi manierâ intâmplâtoare descrisâ anterior, un segment genic DH oarecare este adus în imediata proximitate a unui segment genic JH. Lângâ segmentul DHJH care rezultă astfel este adusâ unul din segmentele genice VH. Rearanjările de la nivelul ADN-ului cromosomului 14 vor conduce la următoarea succesiune, dinspre telomer către centromer: segmentele genice VH neselectate, promotor-ul segmentului genic VH selectat, exonul Leader, un scurt intron, segmentul continuu VDJ, un alt intron, segmentele genice JH neselectate, un intron lung şi întreaga serie de gene constante. Odată rearanjkile terminate, o ARN polimerază se va lega la promotor şi va transcrie întreaga secventă (inclusiv intronii). in acest proces de transcriptie sunt antrenate şi primele douca gene constante, care sunt Cµ şi C8. Rezultă astfel un transcript ARN primar care va urma un proces de matisare şi poliadenilare diferenţiată. Matisarea ARNului va conduce în acest caz nu numai la eliminarea intronilor ci şi la separarea genelor C u şi C8. Dacă într-o primă etapă, segmentul VDJ va fuziona cu C 1, şi astfel primul lanţ greu sintetizat de limfocitul B va fi un lant greu iu. (iar prima imunoglobulină produsă va fi IgM), în etapa imediat umffloare, segmentul VDJ se va asocia, Intr-o manieră cvasialternativă, atât cu gena Cţi cât şi cu gena C. Consecinta acestui proces particular va fi exprimarea simultanâ, pe suprafata aceleiaşi celule B, atât de IgM, cât şi de IgD, având însâ aceeaşi specificitate, determinată de aceeaşi combinaţie distinctă VDJ. 3. MECANISMUL REARANJĂRILOR GENELOR CARE CODIFICĂ PENTRU REGIUNEA VARIABILĂ Rearanjârile genelor decurg aşa cum au fost descrise mai sus, dar se pot pune firesc două întrebări: cum se face oare câ genele sunt asamblate în mod corect, întotdeauna o genă VH este asociatâ cu o genâ DH şi nu direct cu gena J H? Cum se face că asocierea genelor se produce prin unirea segmentelor genice în ordinea corectă 5'-3' şi de ce nu e posibilă rearanjarea a două gene din acelaşi grup (V, D sau J)? inţelegerea mecanismului a apârut odatâ cu identificarea a două secvente conservate la nivelul ADN-ului din genomul celulelor germinale, fiecare dintre ele constând dintr-un heptamer palindromic şi un nonamer bogat în A şi T, separate de câtre o secventă neconservată, formată fie din 12, fie din 23 de perechi de baze azotate. Lungimea acestor "distanţieri" corespunde fie unei spire, fie a douâ spire complete a helix-ului ADN. Aceste secvenţe sunt intronice şi se gâsesc dupâ fiecare segment genic V, înaintea fiecărui segment genic J şi la ambele capete ale segmentelor genice D. Intronii descrişi functioneazâ ca tinte de recunoaştere — secvenţe semnal — pentru enzimele responsabile pentru rearanjarea genelor şi sunt denumite RSS (Recombination Signal Sequence). Rearanjarea genelor este rezultatul actiunii mai multor enzime, denumite generic "recombinaze". Primele astfel de recombinaze responsabile pentru procesele care au loc în limfocite au fost descrise în 1990: genele RAG1 şi RAG2 (Recombination Activating Gene) codifică proteine care, doar dacâ actioneazâ împreunâ, sunt capabile sâ inducă rearanjarea VDJ sau VJ4. Rearanjârile genelor V(D)J — destinate părtilor variabile a imunoglobulinelor — pot fi "productive" sau "non-productive". 0 rearanjare productivă este aceea care va conduce la o secventă VJ sau VDJ care sâ poată fi transcrisâ şi apoi translată in intregime. 0 rearanjare neproductivă decalează cadrul de lectură generând codoni stop care vor bloca translatia iar ReCOMbinaZeie codificate de către RAG 1 şi RAG2, alături de enzima TdT (Terminat deoxinucleotidil Transferaza) sunt singurele care se găsesc doar în limfocite. 4

celulele vor fi eliminate prin apoptoză. Deşi se consideră câ tâierea ADN-ului se face in mod precis la joncţiunea dintre exon şi intronul RSS, procesul ulterior de fuziune a segmentelor genice este adesea imperfect. Aceastâ imprecizie reprezintâ o sabie cu douâ făişuri. Pe de o parte, conferă un imens avantaj limfocitelor, conducând la generarea unui surplus de diversitate, dar, pe de altă parte, poate conduce la rearanjări neproductive. Limfocitele sunt celule somatice diploide şi conţin deci atât cromosomi materni cât şi paterni. Toate genele implicate in codificarea lanţurilor pentru imunoglobuline (ca şi cele pentru TCR T cell receptor, receptorul pentru antigen al limfocitului T) sunt gene dominante. Cu toate acestea, limfocitelor nu li se permite decât utilizarea alelelor de pe un singur cromosom. Fenomenul (unic limfocitelor), a fost denumit "excluzie Singura rearanjare care are loc simultan pe ambii cromosomi este cea dintre genele DH Si toate celelalte desfăşurânduse fie pe un cromosom, fi e pe cel pereche. in acest fel, fiecare limfocit va reţine doar câte o rearanjare productivă VD.1 şi respectiv VJ, astfel încât vor fi produse lanţuri uşoare şi grele având o parte variabilâ, identică. Asamblarea lor va conduce in final la obtinerea de receptori pentru antigen cu o specificitate unică. 4. FACTORI CARE CONTRIBUIE LA GENERAREA DIVERSITÂŢII IMUNOGLOBULINELOR Privind retrospectiv câtre primele douâ teorii emise cu privire la diversitatea reeeptorilor pentru antigen, teoria liniei germinale şi teoria somaticâ, constatâm câ fiecare dintre ele conţine elemente validate ulterior experimental. Prezentâm în continuare o sinteză a mecanismelor care determină, în ultimâ instanţâ, obţinerea acestui număr remarcabil de receptori pentru antigene: (1) in primul rând trebuie remarcat că, spre deosebire de oricare alte proteine sintetizate in organism, codificarea lanţurilor imunoglobulinelor este asiguratâ de mai multe gene, care, ulterior, vor fi asamblate într-o secvenţâ contiguâ. (2) Fiecare dintre aceste gene este aleasâ dintr-un rezervor genic alcătuit din mai multe gene, perfect individualizate. Cel mai bine reprezentat, din acest punct de vedere, este grupul segmentelor genice V, atât cel destinat lanţurilor grele cât şi uşoare. (3) Mecanismul cel mai important, care creează el însuşi diversitate şi oferă în plus posibilitatea intervenţiei unor mecanisme suplimentare ulterioare, este reprezentat de rearanjcirile aleatorii, guvernate de recombinaze. Faptul că aceste reasortâri genice se produc o manierâ intâmplâtoare, fărâ să existe reguli care sâ impunâ combinaţii particulare, lasâ practic posibilitatea formârii oricărei combinaţii de gene5. (4) Paratopul imunoglobulinelor este format din combinaţia pârţii variabile a unui lanţ greu Şi a părţii variabile a unui lanţ uşor. Asocierea dintre un lanţ greu şi unul uşor este de asemenea aleatorie; într-o celulâ B oarecare, intâmplarea poate conduce la sinteza unor lanţuri H şi L oarecare, iar acestea, odatâ asamblate, vor conduce la o combinaţie particulară6. (5) Imprecizia unirii genelor conduce la ceea ce a fost denumită «diversitate joncţională" sau "flexibilitate joncţionalr. Aşa cum menţionam anterior, tâierea dintre RSS şi secvenţa codantă pare sâ, fie precisâ, în schimb, unirea secvenţelor codante este, cel mai adesea, 5 Un calcul simplu ne aratâ câ în cazul lanţurilor grele, dacâ orice gena ❑ se poate combina cu orice gena J şi apoi cu orice genă V, numărul de combinaţii posibile pe care 11 putem obţine este de 51(VH) x 27(DH) x 6(.1H) = 8262. ln cazul lanţurilor uşoare de tip k, calculul ne conduce la 40(Vk) x 5(Jk) = 200 de combinaţii, respectiv 30(VX) x 4(n.) = 120 de combinaţii pentru lanţurHe uşoare 6 Astfel, un calcul simplu ne aratâ câ putem obţine, în cazul asocierii unui lanţ greu cu un lanţ uşor k un numâr de 8262 x 200 = 1 652 400 de variante. Această sumâ, deşi irnpresionantă, este totuşi departe de numârul de specificităţi existente în organism, care alcătuiesc repertoriul imunologic şi care este estimat intre I 0 11:1 şi 1011. Surplusul de diversitate este oferit insâ de mecanisme supiirnentare, care nu s-ar fi putut insâ manifesta în absenţa acestui sistem cu totul deosebit prin care gene, situate la distanţă între ele, sunt alese intâmplâtor, alăturate şi unite pentru a forma o genâ hibrid.

imprecisâ. Joncţiunea genelor va deveni în acest fel un loc major de generare a diversitătii, dat fiind faptul că acest proces este unul practic necontrolabil. 5.1 Regiunea P de adiţie apare după tăierea ADN-ului. Dacă prima clivare apare la jonctiunea RSS-exon, în etapa următoare, nucleotidele de la acest capât vor face în aşa fel incât, în momentul tăierii complete a ambelor catene, acestea să fie unite intre ele printr-o buclă, aşa numitul "ac de pâr". Fenomenul se produce la capetele ambelor gene care urmează să fie fuzionate şi, pentru ca unirea acestor gene sâ poatâ avea loc, "acele de par" trebuie ulterior şi ele tăiate. Această a doua tăiere de către o endonuclează se face, cel mai adesea, asimetric, astfel încât una dintre catene va deveni mai lungă decât cealalaltă. Este necesară interventia unor enzime de reparare care să adauge nucleotide complementare celor prezente la nivelul catenei mai lungi. Se creazâ astfel o secventâ palindromică la nivelul jonctiunii, motiv pentru care aceasfă, regiune a fost denumită "regiune P de adiţie". (a) P-nucleotide addition Hairpin T C ( D I _______

71

-

Cleavage of hairpin 71 generates sites for the addition of P-nucleotides

e i TCG A ATAT

I

Repair enzymes add complementary

— Dnucleotides — F I T c G A T A T A AGLTA 1AT

5.2 in ultimele stadii ale rearanjarii VDJ, odata taiat acul de par, cele doua catene ale ADN ului sunt taiate de catre exonucleaze înainte de a fi reparate de catre ligaze. Se întâmpla frecvent ca exonucleazele sa taie chiar din secventele codante. Dupa ce ADN-ul a fost reparat, secventa genelor rearanjate difera de cea din „germline". 5.3 Regiunea N de adiţie este creată cu ajutorul unei enzime numite TdT (terminal deoxinucleotidil transferaze). Rolul TdT este acela de a adăuga nucleotide la capetele genei D în cursul unirii acesteia la gena J sau la gena V. Numărul maxim de baze azotate pe care enzima le poate alipi genei D este de 15, dar numărul de nucleotide transferat este aleator şi astfel se formează secvenţe complet diferite. (b) N-nucleotide addition Hairpin i

iL

-1111TCi -" •.-% r'FA

A ( A T 71 Cleavage of hairpin 71 generates sites for the addition of P-nucleotides

-11111TCGA

i

ATAT ____

TdT adds N-nucleotides Repair enzymes add complementary

nucleoticks

--leTCGAACITATA

____ AGCTTCAATAT

Ceea ce este important de subliniat în acest moment este câ diversitatea joncţională, adiţia in regiunea P şi în regiunea N şi deleţiile conduc la apariţia unor secvenţe genice complet noi, care nu existau iniţial în genomul celulelor germinale. Aceste mecanisme sunt cele care reuşesc sâ ridice diversitatea Ig-nelor pânâ la cifra avansatâ anterior, de aproximativ 10 14 specificitki diferite. (6) Un alt mecanism implicat în generarea diversităţii este constituit de mutaţiile somatice ce se produc întâmplător, printr-un mecanism încă neelucidat, la nivelul genelor rearanjate (VJ sau VDJ). Un element deosebit este reprezentat de ftecvenţa crescutâ (hipermutaţii) cu care aceste mutaţii apar, de cel puţin o sutâ de mii de ori mai inaltă decât frecvenţa cu care apar mutaţiile spontane la nivelul oricâror alte gene 7. Acest fenomen este caracteristic limfocitelor B rnature care raspund faţa de un antigen si are potenţialul de a genera maturaţie de afinitate. 5. ASOCIEREA GENEI CONSTANTE ŞI COMUTAREA DE CLASÂ Organizarea genelor ce codificâ partea constantă a lanţurilor este diferitâ de cea responsabilâ pentru partea variabilâ. in cazul lanţurilor uşoare, existâ o singurâ genâ Ck şi mai multe gene C?„, dar partea constanta a lanţurilor uşoare nu influenţeazâ nici paratopul şi nici clasa imunoglobulinei respective. De mult mai mare importanţâ este insâ partea constantă a lanţurilor grele, responsabilâ pentru determinarea isotipului şi a funcţiilor numite "biologice" ale anticorpilor. Genele pentru regiunile constante sunt mult mai lungi decât cele pentru regiunile variabile, fiind alcâtuite dintr-o serie de exoni distincţi ce codificâ fiecare în parte domeniile extracelulare, regiunea "balama" (acolo unde este cazul), domeniul transmembranar şi coada intracitoplasmatică. 0 caracteristicâ a genelor CH este prezenţa unor gene multiple în genomul celulelor germinale, corespunzâtoare fiecărei clase şi subclase de imunoglobuline. Ultima genă. JH este separatâ de prima genâ CH printr-un intron foarte lung. in plus, fiecare genă CH este precedatâ nu numai de promotor, dar şi de un amplificator aI transcripţiei (enhancer) precum şi de câte o secvenţâ intronicâ denumitâ "switch" (comutare), caracteristică freckei gene în parte; o excepţie notabilâ este reprezentatâ de gena Cs, lipsitâ de secvenţa de comutare. Secvenţele de comutare sunt destul de lungi, fiind alcâtuite din mai multe motive repetitive. Rolul acestor introni este acela de a permite asocierea la acest nivel a unor recombinaze care sunt diferite pentru fiecare clasâ în parte. in timpul diferenţierii limfocitului B, genele C i, şi Cb, cele mai apropiate de genele J, sunt primele transcrise. Ca un element particular, ambele gene sunt transcrise simultan, probabil tocmai datoritâ absenţei secvenţei de comutare din faţa genei C8, precum şi a distanţei de numai 5 kb dintre cele douâ gene. Astfel, transcriptul primar, cu o lungime de aproximativ 15 kb, conţine genele VDJC1,C8. Dintre cele patru situsuri de poliadenilare, primele două sunt asociate genei C u , iar celelalte douâ genei Ca. Dacâ transcriptul primar este clivat şi poliadenilarea are loc la nivelul situsului 2, atunci ARN-ul mesager va conţine întreaga secvenţă a genei Cu şi va rezulta astfel forma membranară a lanţului. Dacâ însâ poliadenilarea se face la nivelul situsului 4, atunci, prin tâierea ARN-ului, secvenţa C 1, va fi inlâturatâ şi se va ajunge la ARNm care codifică pentru forma membranarâ a lanţului C8. Acest proces se produce simultan, astfel că secvenţa VD.1 are posibilitatea să se uneascâ, de o manierâ alternativă şi cu gena şi cu gena C. in consecinţă, limfocitele B mature dar naive vor Se pare câ anumite motive de nucleotide şi secvenţe paiindromice de la nivelul genelor rearanjate (VJ sau VD.I) sunt în mod particular susceptibile în faţa acestui mecanism, în limfocitele B mature fiind afectate preferenţiai acele secvenţe care codifică regiunile hipervariabile (CDR). În mod normal, hipermutaţiile somatice au loc în centrul germinal (deci în organele limfoide secundare), ca o consecinţâ a expunerii ] a antigen; acele limfocite B care au receptorul cu cea mai mare afinitate pentru antigenui respectiv vor fi selectate în mod preferenţial, vor supravieţui şi tot dintre acestea se vor diferenţia şi celulele cu memorie. Procesul a fost denumit "maturaţie de afinitate". 7

9

exprima simultan pe suprafaţâ atât IgM cât şi IgD, dar cu aceeaşi specificitate, determinată de către aceeaşi combinaţie Dupâ stimularea antigenică însâ, expresia IgD este pierdutâ, iar IgM tinde sâ fie înlocuitâ, în cele mai multe cazuri, cu un alt isotip, fenomen denumit "comutare de clasr. Astfel, gena va fi inlocuitâ cu o alta, situatâ spre capâtul 3' al ADN-ului. Trebuie subliniat însâ că acest proces are loc în timpul vieţii adulte a limfocitului B şi noi rearanjări genice nu mai sunt posibile; odatâ ce limfocitul a ajuns la o anumită reasortare productivâ, aceasta va deveni permanentă pentru celula in cauzâ. Astfel, comutarea de clasâ nu influenţează specificitatea imunoglobulinei respective. De asemenea, trebuie precizat câ procesul de comutare de clasâ are loc în contextul unui râspuns imun faţă de un antigen T-dependent, cu alte cuvinte, un răspuns imun în care sunt implicate şi limfocitele T helper, prin intermediul anumitor seturi de citokine şi molecule de suprafaţâ8.

Isotypeswitching __________________________ 1___________________________

Răspunsul faţă de antigenele T independente, în absenţa intervenţiei limfocitelor T helper, nu conduce nici la memorie imunologică şi nici la comutare de clasâ. 8

?i0

6. SECRETIA ANTICORPILOR În cazul când limfocitul B s-a diferenţiat în plasmocit, sinteza imunoglobulinelor de suprafaţă este înlocuită de cea de anticorpi. Diferenţa nu se regâseşte la partea variabilâ (in mod esenţial, specificitatea anticorpilor este aceeaşi cu a imunoglobulinelor de pe suprafaţa limfocitelor B stimulate iniţial) ci la nivelul secvenţei situatâ spre capâtul C-terminal al pârţii constante. Posibilitatea sintezei unei forme sau a alteia se datoreazâ existenţei unor exoni suplimentari, denumiţi M1 şi M2, localizaţi in aval de exonul responsabil pentru ultimul domeniu extracelular constant. Exonul Ml codifică porţiunea transmembranark iar M2 porţiunea intracitoplasmatică. Dacâ poliadenilarea se produce la nivelul situsului 1 de la nivelul transcriptului primar, atunci exonii M1 şi M2 sunt pierduţi şi se va ajunge la forma secretatâ a lanţului greu respectiv. DNA. 5'

Cp.1 Cţi2 C113 C p.4 Se

11#2

,~D H M0=5=E1--1=1:311::

Pciyadenyialion 3' of N12

Polyadenyletion 3' of Se

Primary ttanscript Cp.1 Cp2

# •

RNA splicing

cps

Se M1 M2

Membrane-bould IgM

AAA. mRNA. Jor 1.11.

RNA Poty.A. ăite

Primarytranacript

Af1M2

11.1DH Jii 111115MEIME111 11 rn RNA for p.

-Ncretedci.L3 IgM Cii4Se

5.

-

concluzie, formarea imunoglobulinelor este consecinţa unui proces genetic absolut distinct, unic receptorilor pentru antigene, cu o mulţime de excepţii de la regulă. Astfel, un singur peptid va trebui codificat de mai multe gene, iar elementul principal al întregului proces este reprezentat de rearanjarea la intâmplare a mai multor gene destinate regiunii variabile. in plus, genele care codifică pentru regiunile constante sunt fuzionate doar la nivel de ARN, ceea ce va crea premizele asocierii alternative ale genelor CI.1 si C8, într-o primă instanţâ şi apoi ale comutârii de clasâ. in ciuda faptului câ genele implicate in formarea imunoglobulinelor sunt dominante, datorită excluziei alelice vor putea fi exprimate doar alele de pe un cromosom sau altul.

MECANISMELE GENETICE CARE STAU LA BAZA GENER ĂRII DIVERSITÂŢII TCR Între imunoglobuline şi receptorul pentru antigen al celulei T (TCR) există multe asemănări din punct de vedere structural. Domeniile extracelulare care alcătuiesc cele două lanţuri sunt, ca şi la Ig, constante şi variabile, intreaga porţiune extracelularâ a TCR searnănă cu fragmentul Fab al anticorpilor 9,iar componenta dedicatâ recunoaşterii este asociatâ cu molecula constantă CD3 (analogâ Iga şi IgP, cu rol în transmiterea intracelulară a semnalului). Mecanismul de formare a receptorului pentru antigen al limfocitelor T prezintă foarte multe aspecte extrem de asemănătoare cu cel al formării imunoglobulinelor, implicând, în esenţă, rearanjări genice V(D)J şi diversitate joncţională. Analiza lanţurilor TCR demonstrează de asemenea existenţa regiunilor hipervariabile, responsabile pentru formarea efectivâ a situsului de interacţiune al receptorului. Din aceste motive, am ales să ne concentrâm în special asupra diferenţelor de formare a celor două categorii de receptori. 0 primă deosebire notabilă este reprezentată de existenţa a două tipuri de TCR: TCR 1 (y8) şi TCR 2 (ap). Indiferent de tipul de TCR, acesta este asociat la nivel transmembranar, prin legături electrostatice, cu aceeaşi moleculă CD3. Există 4 familii de gene la nivelul ADN-ului din genomul celulelor germinale, dedicate câte unui anumit tip de lanţ. Genele care codifică lanţurile a şi 8 sunt grupate pe cromosomul 14 (în altâ regiune decât genele pentru lanţul greu al imunoglobulinelor), iar genele lanţurilor şi y pe cromosomul 7. Localizarea particularâ a genelor 8 nu este intămplătoare. Atunci când celula reuşeşte sâ ajungă la o rearanjare productivă a genelor pentru lanţul a, genele lanţului 5 sunt deletate; astfel, la nivelul unui anumit limfocit T, nu poate exista o expresie simultană de TCR aP şi TCR y8. A. Huma n TCRA Locus Va1

S'

51~ L1

Va2

Van-42

Jal

Ja61

----------[ffill=11=111.1...........111 L2

Ca

Sc Ea

9' \.\\

Ln-42 1 TCRO

C exon 7.:

Cl C2 C3 C4

A. Hurnan TCRB Locus

vpi

vp2

'

vpn-4e.

5

L1

DI31 J1310•6) C131

D132 420_7) cp2

EI3

3,

__=e111, ,11111r L2

Ln-48

Domeniul Ca nu este organizat ca un domeniu globular. Conformaţia TCR pare sa fie mai rigidă, decăt a 1g datoritâ interacţiunilor dintre domeniile fiecărui lanţ, posibil şi datorită diferenţei dintre sistemul de recunoastere a Ag propriu al fiecărui receptor. 9

:~4~:

A. Huinan TCRG Locus 5,

V y1 V y2 -4

L2-4

Vy6-13 Vy9 Vyi 0 Vy1 1 Vyl 2-14 Jy10.3)

Vy5

L5

L9

Jy20

cy2

Sy Sy EY

9,

L11

A. Hurnan TCRD Locus

Ja 3' 1l81 L1

111111=4. D81-3 J81-3 E8 C8

V82 L2

L3

V84 1I85-10 L4

L5-10

Reasortarea genelor se face sub influenţa enzimelor codificate de aceleaşi RAG1 şi RAG2, s i s t e m u l d e r e c u n o a ş t e r e a g e n e l o r e s t e r e p r e z e n t a t d e a c e e a ş i s e c v e n ţ â heptameridistanţier/nonamer, fuziunea secvenţelor genice conduce la imprecizie joncţionalk la care se adaugâ imprecizia inserţională. Existenţa mai multor gene D sau J, grupate distinct, poate conduce la unele diferenţe de rearanjare1° .

A. TCRA

B. TCRB

_~

51

2 3'

Sistemul distinct de repartizare al RSS-urilor in cazul genelor TCR permite ca segmente genice V sa fuzioneze direct cu segmente genice J. Spre deosebire insa de segmentele genice D utilizate de limfocitele B (flancate de RSS-uri formate din cate 12 nucleotide si care astfel nu pot fuziona unele cu altele), pana la 3 segmentele genice D ale TCR-ului uman pot fuziona, inainte de unirea cu segmentul genic J. Ca urmare, desi numarul de gene din grupul V este mai mic decat cel de la Ig, repertoriul TCR este mai mare decat al imunogloblinelor, tocmai datoritâ unei enorme variabilitâţi joncţionale şi inserţionale (regiune N de adiţie, regiune P de adiţie). Aceleaşi mecanisme reprezintâ, în acelaşi timp, şi un factor de risc, putând conduce la rearanjări neproductive care fie fac produsul nefuncţional, fie fac ca secvenţa de ADN să nu mai poată fi cititâ (introducerea unor codoni st❑p). 0 diferenţă imp ❑rtantă intre procesele de formare ale celor doi receptori este aceea câ, în urma activârii antigenice, genele TCR nu suferâ hipermutaţii somatice. Absenţa mutaţiilor întâmplătoare reprezintă ❑ măsură de siguranţâ, iimpotriva apariţiei limfocitelor autoreactive, cu atât mai importantă cu cât limfocitele T au un sistem de recunoaştere particular, care vizează nu doar antigenul - non-self - ci şi molecula de MHC (Major Histocompatibility Complex — Complex Major de Histoc❑mpatibilitate) —self - care prezintă, acest antigen.

Astfel, dacâ în cazul genelor lanţului p este aleasâ gena ❑2, aceasta se va putea asocia doar cu o genâ J din al doilea grup. Dacâ este aleasâ însă gena D1, rearanjarea va putea asocia, într-o manierâ aleatorie, fie o genă J din primul gntp, fie din al doilea. 1°

Formarea TCR incepe în corticala timusului, într-o etapâ de dezvoltare a timocitelor t 1 când acestea şi-au câştigat expresia moleculei CD3, enzima TdT este de asemenea prezenfă, dar nici una dintre moleculele co-receptor (CD4 şi CD8) nu au apârut încâ — m❑tiv pentru care celulele sunt denumite dublu negative (DN). Primele gene care incep sâ se rearanjeze, mai mult sau mai puţin simultan, sunt cele pentru lanţurile p şi y. Dacâ genele y suferâ o reasortare productivâ, începe şi rearanjarea genelor 5. Dacâ atât genele pentru lanţurile y cât şi cele pentru lanţurile 8 sunt rearanjate productiv, cu alte cuvinte transcriptia poate avea loc şi poate începe sinteza lanţuril ❑r, alte rearanjâri nu vor mai avea loc şi acele timocite vor rămâne y5 şi se vor dezvolta, pe o cale diferită, în celule DN, CD3+ y5. Acestea vor reprezenta aproximativ 5% din totalul timocitel ❑r la adult. Majoritatea timocitelor dublu negative aleg însă o altâ cale de dezv❑ltare. Dacă rearanjârile y şi/sau 5 nu sunt funcţionale, vor continua rearanjările Odată ce celula a ajuns la o rearanjare TCRp productivâ sunt suprimate alte rearanjări ale lanţurilor p-TCR (componentâ a fenomenului de excluzie Astfel sunt selectate acele timocite care exprimă lanţul p pentru o expansiune şi maturare ulterioară. Din acest moment, pot fi declanşate rearanjările pentru lanţul a, iar acele timocite care vor ajunge la rearanjâri productive vor fi capabile sâ exprime pe suprafaţâ un TCR ap complet format, chiar dacâ, la nivele scâzute. Timocitele sunt în continuare dublu pozitive şi se gâsesc la nivelul corticalei profunde a timusului. De aici incolo, aceste celule v ❑r suferi o serie de pr ❑cese complexe, cunoscute sub numele de selecţie pozitivâ şi negativă. Selecţia pozitivă are loc la nivelul corticalei pr ❑funde, sub influenţa celulelor epiteliale corticale. Acele timocite care sunt capabile sâ recunoască prin intermediul TCR-ului moleculele MHC (cu o afinitate medie) sunt selectate pozitiv, vor supravieţui şi vor primi semnale care le vor determina sâ prolifereze. Consecinţa acestui fenomen este ceea ce se numeşte "restricţie MHC", sau, cu alte cuvinte, capacitatea limfocitelor T de a recunoaşte antigenul doar in contextul moleculelor MHC proprii organismului respectiv. Celulele care nu corespund acestui criteriu sunt eliminate prin apoptozâ. Excluzia funcţioneazâ cu maximâ stricteţe cazul formârii imunoglobulinelor. 'in cazul TCR-ului însâ, dacă pentru lanţul excluzia alelica pare sâ reprezinte regula, în cazul lanţurilor a este mai puţin strictl in cazul in care se produc rearanjări productive pe ambii cromosomi, cele două lanţuri a diferite vor conduce la existenţa simultanâ a douâ TCR-uri cu specificifăti antigenice diferite. Deşi nu existâ un consens asupra numărului de astfel de limfocite T mature circulante, se pare că în astfel de situaţii doar unul dintre cei doi receptori reuşeşte sâ treacâ de procesele de selecţie (in special de selecţia pozitivâ şi ca urmare sâ fie MHC-limitat). Numârul celulelor care posedâ un receptor corespunzâtor din acest punct de vedere este mic şi, ca urmare, o serie din celulele care nu au fost selectate pozitiv au posibilitatea să îşi reia rearanjările pentru lanţul a. Dacâ noua rearanjare va fi productivâ, existâ potenţialul de a conduce la ❑ nouă specificitate. Acest fenomen este denumit "editare" iar timocitul câruia i se oferâ aceastâ şansâ va trebui sâ treacâ din nou prin procesul de selecţie pozitivâ. La nivelul joncţiunii cortico-medulare, unde se gâsesc celule cu origine hematogenâ (macrofage şi celule dendritice) şi mai departe în corticala medulară, sub influenţa celulelor epiteliale de la acest nivel, are loc procesul de selecţie negativăl2. Eliminarea prin procesul de selecţie negativă a timocitelor care poartâ receptori de mare afinitate pentru molecule MHC self singure sau pentru antigenul self prezentate de MHC, conduce la toleranţâ faţâ, de self.

Limfocitele T din timus, aflate în plin proces de diferenţiere, sunt denumite timoeite. Selecţia pozitivă a limfocittdui B are altâ semnificaţie (exprimarea unui receptor intermediar); selecţia negativă se referâ ins'ă de asemenea la eliminarea limfocitelor B autoreactive II

i a

Deoarece procesul are loc în timus, este denumit toleranţă centrală. Sunt astfel practic eliminate fizic un număr important de limfocite autoreactive13. Recunoaşterea unui tip de MHC sau altul are o consecinţă suplimentarâ: acele timocite care au recunoscut un MHC I se vor diferenţia în continuare in limfocite T citotoxice (CD8+ CD4-), iar cele care au recunoscut MHC II se vor diferenţia in limfocite T helper (CD4+ CD8-). I- A. B I E 1 1 1 TCR MULTIGENE FAMIL1ES -

--

1N HUMANS No. of t;„.ene. wgments Gene

Chrotnosortţe location

V

a Chain

50 70 I 14 14 3 3 3 1 - . "Thei ` Chain' gcne segments arc locatcd between the V„ and I„ segments. 7 57 ., 13 .> There are two repeats, each containing 1 0.3, 6 or 7 .10, and 1 Ce,, 7 14anci I C..,. 5 2 There13 are t.wo repeats, each containklg 2 or 3 J, #

4

SOURCE: Data front PAH Moss et al. f992, Ayirnr. Rev. Imerrund 10:71,

Acest proces nu este perfect; va continua în periferie, dar aici vor fi implicate mai degrabă alte mecanisme decât inducerea apoptozei celulelor. 13