Review Jurnal Fix

REVIEW JURNAL

Judul Jurnal

: Transcriptional and post-transcriptional regulation of pst2 operon expression in Vibrio cholerae O1 (Regulasi Transkripsi dan Post-transkripsi dari ekspresi

Nama : Volume Tahun

Operon pst2 pada Vibrio cholerae O1) Jurnal Infection, Genetics and Evolution :

Vol. 51 2017

: Penulis

Daniel M. da C. Leite, Livia C. Barbosa, Nathalia

:

Mantuano, Carolina L. Goulart, Giovani C. Veríssimo da

Reviewer

Costa, Paulo M. Bisch, Wanda M.A. von Krüger M. Ali Azis Hasan Rizki

:

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Vibrio cholerae merupakan bakteri Gram-negatif yang ditemukan pada habitat laut, muara dan air tawar serta hidup bebas atau melekat pada lembam dan hidup di permukaan. Vibrio cholerae strain O1 dan O139 penyebab terjadinya kolera dengan gejala penyakit diare berair yang berat dan menimbulkan ribuan kematian setiap tahunnya, terutama di negara-negara dengan kondisi sanitasi dan kebersihan yang kurang optimal (Faruque et al., 1998; WHO, 2012). Vibrio strain patogen cholerae yang hidup di usus manusia berbeda dengan yang hidup di ekosistem perairan. Vibrio cholera bertahan hidup dan bereproduksi dengan mengekspresikan gen yang terkait dengan respon adaptif. Lingkungan perairan alami umumnya kekurangan nutrien seperti fosfor. Kelangsungan hidup Vibrio cholerae pada suatu medium tergantung pada kemampuannya untuk mengatasi kekurangan fosfor. Sebagian besar organisme menggunakan fosfat anorganik (Pi) sebagai sumber utama fosfor dan respon defisiensi Pi mengakibatkan ekspresi gen yang dikenal sebagai Pho regulon (Wanner, 1993). Pada bakteri Gram-negatif termasuk Vibrio cholerae, ekspresi gen ini berada di bawah kontrol transkripsi dari sistem regulasi dua-komponen PhoR / PhoB. Sistem ini terlibat dalam patogenesis dan diperlukan untuk pertumbuhan bakteri serta akumulasi RpoS di bawah kondisi Pi yang tinggi. Salah satu protein yang paling melimpah pada Vibrio cholerae O1 yang tumbuh di bawah inorganic phosphate (Pi) yang terbatas adalah PstS, gen PstS merupakan gen pertama dari pst2 operon, yang meliputi PSTS-pstC2- pstA2-pstB2 pada strain N16961 dan O395. Strain Vibrio cholerae O1, O395 dan N16961 memiliki operon pst yang berbeda, pst1 mengandung empat gen, pstC1-pstA1-pstB1-phoU dan operon pst2

satu-satunya dari strain ini yang mengkodekan sistem transportasi ABC tipikal yang terdiri dari protein pengikat Pi periplasmic (PstS), dua integral membrane permeases (PstC dan PstA) sebgai transport Pi untuk melintasi membran dan protein pengikatan ATP (PstB). komponen pi-binding periplasmic dari sistem transport Pi afinitas tinggi Pst2 (PstSCAB), dikodekan dalam pst2 operon (pstS-pstC2-pstA2 -pstB2). Selain perannya dalam penyerapan Pi, Pst2 juga dikaitkan dengan virulensi Vibrio cholerae. Pentingnya sistem transport Pi pada Vibrio cholerae O1 secara physiology dan pathogenesis belum banyak diketahui mengenai regulasi ekspresi pst2 dan mekanisme terjadinya produksi non-stoikiometri dari komponen Pst2 dengan Pi terbatas. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan dengan pendekatan secara eksperimental yang bertujuan untuk menjelaskan mekanisme regulasi di balik ekspresi pst2 pada Vibrio cholerae O1. 1.2.

Tujuan 1.2.1. Untuk mengetahui mekanisme regulasi ekspresi pst2 pada Vibrio cholerae O1 1.2.2. Untuk mengetahui mekanisme produksi non-stoikiometri dari komponen pst2 dengan p1 yang terbatas.

BAB II METODOLOGI 2.1.

Strain bakteri dan kondisi pertumbuhan Escherichia coli DH5α, Vibrio cholerae O1 strain N16961SR (mutan yang

resisten terhadap streptomisin dari N16961) dan WK10 (N16961 isogenic phoB mutant yang mengalami delesi), (Goulart et al., 2009) ditumbuhkan pada media Lysogeny Broth (LB). Pertumbuhan bakteri dilakukan dengan konsentrasi PI yang telah ditentukan, sel-sel sebelumnya dikultur pada media LB sampai OD 600 nm 0,50,7, setelah itu di sentrifugasi (10.000 × g selama 10 menit pada suhu 4°C), dicuci dua kali dalam TG (Tris-HCl pH 7,4, glukosa, campuran garam mineral), ditransfer ke media TG yang dilengkapi dengan KH2PO4 pada 6,5 mM untuk tingkat Pi tinggi (TGHP) atau 65 μM untuk tingkat Pi rendah (TGLP) pada OD 600 nm sekitar 0,5, dan selanjutnya diinkubasi selama 4 jam (von Kruger et al., 1999). Streptomisin, ampisilin (keduanya pada 100 μg mL − 1) dan kanamycin (50 μgmL − 1). Pertumbuhan bakteri dilakukan dengan mengojok pada 200 rpm dan suhu 37 ° C. 2.2.

Prosedur Kloning Fusi promotor-lacZ digunakan pada vektor promoter-probe pIC552 dan

fragmen DNA yang diperoleh dari hasil PCR, DNA yang digunakan berasal dari kromosom N16961 sebagai template. Segmen 200 bp upstream gen pstS dan 280 bp pada 5′ dari pstS open reading frame (ORF), diperkuat menggunakan pasangan primer Pro1Fw, Pro2Rv, PstNprFw dan PstNprRVibrio Produk PCR dimurnikan dengan gel, didigesti dengan NcoI, XhoI dan dikloning menjadi pIC5552, didigesti dengan enzim yang sama untuk menghasilkan pIC200 dan pIC280. Konstruksi dikonfirmasi dengan PCR dan analisis sekuensing (ABI PRISMBigDye Terminator siklus sequencing; Applied Biosystems)

2.3.

Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) EMSA dilakukan menggunakan LightShift ™ Chemiluminescent EMSA

Kit (Thermo Fisher Scientific). Komposisi buffer pengikat 1 × adalah 10 mM Tris, 50 mM KCl, 1 mM DTT, pH 7,5 plus 5 mM MgCl2 dan poli (dI.dC) pada jumlah akhir 50 ng / μL. Probe dengan label biotin disiapkan dengan PCR menggunakan DNA dari kromosom N16961 sebagai template dan primer PstNprFwBiot, PstNprRVibrio Produk PCR dimurnikan menggunakan gel agarosa dan dikuantifikasi. PhoB dimurnikan dan Campuran reaksi antara PhoB dengan 280 pb di daerah pstS mengandung 15 ng probe dan 0,5 μg PhoB. Uji kompetensi, dilakukan pada 150 ng fragmen DNA tanpa label yang ditambahkan primer PstNprFw dan PstNprRv ke dalam reaksi. 2.4.

Preparasi sampel protein dan analisis gel elektroforesis Vibrio cholerae N16961SR dan WK10 ditransformasi dengan vektor

rekombinan pIC280 (von Kruger et al., 1999) dan sel transforman yang dikulturkan dalam TGHP dan TGLP. Lysate sel disekeliling disiapkan, dianalisis menggunakan SDS-PAGE pada 11% gel poliakrilamida dan protein yang diwarnai dengan Coomassie Blue (von Kruger et al., 2006). 2.5.

Identifikasi protein Band protein dimurnikan dari gel, didigesti dengan tripsin (Shevchenko et

al., 1996) dan dianalisis oleh MS ESI-Q-Tof Mikro (Waters Corporation, USA) kemudian digabungkan dengan NanoUPLC (Nano Ultra Performance Liquid Chromatography-nanoACQUITY Waters) seperti yang direkomendasikan oleh MIAPE-Informasi Minimum Tentang Proteomics Experiment (Taylor et al., 2007). Rawdata diproses menggunakan ProteinLynx 2×4 setelah itu protein diidentifikasi (von Kruger et al., 2006) 2.6.

Ekstraksi RNA dan Sintesis cDNA

Vibrio cholerae N16961SR sel yang tumbuh di TGLP (von Kruger et al., 1999) dan kultur dibagi menjadi lima 5-mL aliquote. Pada waktu nol, 15 μL larutan rifampicin (50 mg mL − 1 dalam etanol / 0,1 M K2CO3, 1: 1) ditambahkan secara individual ke empat sampel, dan yang kelima digunakan sebagai kontrol. Sel kontrol dikumpulkan segera dengan penyaringan ke 0,45 pM membran MF-Millipore standar. Sampel lainnya dibiarkan pada suhu kamar selama 2.5, 5, 10 dan 20 menit kemudian penyaringan dimulai 1 menit sebelum titik sampling masing-masing. Setelah penyaringan, setiap filter ditempatkan dalam 1 mL sampel TRIzol® (Invitrogen) dan RNA diekstraksi sesuai dengan instruksi pabrik. Integritas RNA divisualisasi menggunakan elektroforesis dengan gel agarose 1%, kemudian dilakukan pewarnaan etidiumbromide. Hasil RNA dan kemurnian ditentukan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 260/280 nm (Sambrook et al., 1989). Pada proses transcriptase digunakan 2 μg RNA yang ditreatmean menggunakan RQ1 RNase-free DNase (Promega) kemudian reaksi dilakukan menggunakan M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen) dan primer heksamer acak (Fermentas) 2.7.

Analisis PCR Sampel cDNA berasal dari sel RNA Vibrio cholerae O1 N16961SR yang

tumbuh di TGLP sebelum perlakuan rifampicin yang digunakan sebagai template dalam PCR endpoint. Reaksi, polimerase DNA GoTaq (Promega) dan tiga pasangan primer yang berbeda (PstSFw / PstCRv, PstCFw / PstARv, dan PstAFw / PstBRVibrio Amplicons divisualisasi menggunakan elektroforesis dengan gel agarose 1% yang sudah dilakukan dengan pewarnaan etidium bromide (Sambrook et al., 1989). DNA genomik dan reverse transcriptase nontreated RNA sampel digunakan sebagai kontrol positif dan negatif. 2.8.

Evaluasi stabilitas mRNA Kuantitatif Real-Time PCR (qRT-PCR) dilakukan pada StepOne Plus Real-

Time PCR System (Applied Biosystems). Primer (Tabel 1) dirancang menggunakan

perangkat lunak Primer Express (Applied Biosystems) untuk memperkuat bagian sentral dari setiap transkrip operon pst. Pada setiap pasangan primer, serangkaian pengenceran cDNA 10 kali lipat digunakan untuk menghasilkan kurva standar dengan memplot nilai siklus ambang (Ct) terhadap log dari kuantitas awal template yang sesuai. R2 (koefisien determinasi) diperoleh dan diamplifikasi PCR (E) dihitung dari kurva kemiringan standar, menurut persamaan: E = [10 (−1 / - slope) - 1] × 100. Penentuan kelimpahan relatif dari masing-masing transkrip, qRT-PCR ditetapkan sebagai berikut: A 15 μL qRT-PCR berisi 7.5 μLMaxima SYBR Hijau / ROX qRT-PCRMasterMix (Fermentas), 0.8 μM pasangan primer khusus untuk setiap transkrip (pstS, pstC, pstA atau pstB) dan 3 μL template (cDNA diencerkan setidaknya 10 × dalam air). Kondisi reaksi sebagai berikut: 5 menit pada 95 ° C untuk denaturasi awal, diikuti oleh 40 siklus 15 detik pada 95 ° C dan 1 menit pada 60 ° C. Setelah siklus terakhir, produk PCR didenaturasi panas melalui gradien suhu dari 60 ° C hingga 95 ° C pada + 0,3 ° C / s. Semua percobaan dilakukan dengan tiga sampel biologis dan tiga rangkap teknis untuk setiap sampel. ΔCt dihitung sebagai perbedaan antara rata-rata nilai Ct dari rangkap tiga untuk setiap gen target (pstS, pstC, pstA atau pstB) dan kontrol endogen (rpoB). Jumlah transkrip pstS yang relatif terhadap transkrip pst lainnya (pstC, pstA atau pstB) ditentukan dengan menghitung ΔΔCt (ΔCtpstS - ΔCtpstC, A, B). Ekspresi 2− [ΔΔCt] digunakan untuk kuantifikasi relatif pstS transkrip. 2.9.

Tes- Enzimatik Sel Vibrio cholerae N16961SR pembawa plasmid rekombinan pIC200 atau

pIC280 ditanam di TGHP atau TGLP. Aktivitas β-galactosidase dan alkaline phosphatase (PhoA) diukur dalam lisat sel (Goulart et al., 2009; von Kruger et al., 1999) dan diekspresikan dalam protein U × µg − 1 (Protein Assay Dye Reagent, BioRad). 2.10. Analisis Bioinformatik

skuens protein dialignment menggunakan parameter standar Clustal Omega (Sievers et al., 2011). Prediksi peptida sinyal dilakukan menggunakan Signal P 4.1 (Petersen et al., 2011) yang ditetapkan untuk bakteri Gram-negatif. Struktur sekunder RNA dan nilai energi bebas (ΔG) yang sesuai diperoleh dengan menggunakan program Mfold, pada parameter default (Zuker, 2003), dan representasi struktural yang dihasilkan menggunakan Varna (Darty et al., 2009). Terminator Rhoindependen pada 3′ akhir mRNA pst2 diidentifikasi menggunakan WebGeSTer DB (Mitra et al., 2011). Wilayah yang memperluas 200 bp upstream dari situs awal penerjemahan putatif di Vibrio cholerae N16961 dan genom O395 dianalisis keberadaan kotakkotak yang konserve. Kotak pho yang dicirikan dengan baik dari E. coli (Salgado et al., 2013), S. meliloti (Yuan et al., 2006b) dan Vibrio cholerae (Diniz et al., 2011), bersama dengan kotak yang diidentifikasi dalam promotor pstS banyak spesies bakteri (Yuan et al., 2006b) digunakan untuk membangun matriks berat. Program komputer Hidden Markoff Model berbasis MEME / MAST (Bailey et al., 2009) digunakan untuk mencari kotak pho putatif, yang didefinisikan ketika p-value adalah b0.0001.

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 PstS upstream region pada Vibrio cholerae O1 mengandung elements untuk transcripsi operon dalam pst2 dibawah Pi limitation pada a PhoB-dependent manne

Hasil dari penelitian tersebut bahwa dibutukan pendekatan bioinformatika untuk mengkaji ulang Vibrio cholerae O1 pstS untuk memulai kodon, ini merupakan suatu hal yang penting karena penentuan pstS ORF dan pst2 operon regulatory

Gambar 1. Squence Vibrio

region. Multiple N-terminal alignment urutan protein PstS dari Escherichia coli, Vibrio cholerae O1 dan

Vibrio lainnya menunjukkan tingkat konservasi yang tinggi dalam segmen protein di seluruh spesies (Gambar 1). Akan tetapi, protein dari strain Vibrio cholerae O1 N16961 dan O395 menunjukkan tambahan 26-residue long sequence pada ujung Nterminalnya. PstS merupakan protein periplasmik, daerah N-terminal mengandung sinyal peptida. Analisis urutan asam amino PstS yang ditentukan dari spesies E. Coli dan Vibrio oleh SignalP 4.1, mengidentifikasi sinyal peptida 22-residu yang sangat konserve, fitur kunci dari sekuens sinyal Sec-khas dari protein bakteri (Gambar. S2) (Pohlschroder et al., 2005). Vibrio cholerae O1 PstS menunjukkan panjang putative signal-sequence peptide, pstS mulai anotasi kodon (Gambar 1) (von Kruger et al., 2006). PstS asli dari Vibrio cholerae O1 sebenarnya lebih pendek dari yang diperkirakan dan bahwa metionin dalam urutan MKKTV adalah residu pertamanya, seperti pada homolog. Secara bersamaan, temuan ini menunjukkan bahwa Vibrio cholerae O1 native PstS memiliki MKKTVIGA pada ujung N-terminalnya, dan urutan KETISAV setelah diproses menjadi protein matang, sebagai homolognya (Gambar 1). Penentuan sebelumnya dari urutan KETISAVGSNXVTPL di ujung terminal N dari bentuk PstS yang matang pada Vibrio cholerae O1.

Setelah pstS ORF yang benar telah ditentukan, peneliti berusaha mencari promoter operon pst2. Berdasarkan tujuannya fragmen 280 bp berlangsung upstream dari kodon yang memulai translasi pstS diprediksikan menyatu dengan upstream gen lacZ pada pIC552 untuk membentuk pIC280 (Gambar 2A). Aktivitas β-galactosidase diukur pada sel N16961SR wild type dan mutan phoB WK10, menyimpan pIC280 atau vektor kosong, pIC552, yang tumbuh di TGHP dan TGLP. Aktivitas βgalaktosidase di atas tingkat basal hanya terdeteksi pada sel N16961SR / pIC280 yang tumbuh di TGLP, yang juga menyatakan tingkat tinggi alkalin fosfatase, reporter Pho regulon alami (Gambar 2B – C).

Gambar 2. Aktivitas pengukuran sel

Selanjutnya, analisis SDS-PAGE sel Vibrio cholerae O1 N16961SR / pIC280 yang tumbuh di TGHP dan TGLP menunjukkan profil protein yang berbeda

(Gambar. S3). Di antara sel-sel utama TGLP yang dikulturkan, diidentifikasi tiga produk gen Vibrio cholerae Pho regulon (PstS, GenBank: AAF95984.1; alkalin fosfatase, GenBank: NP_232434.1; porin VCA1008, GenBank: NP_233392.1) (Goulart et al. , 2010; Goulart et al., 2009; von Kruger et al., 2006) dan E. coli βgalactosidasemonomer (Arg-599-Ala), produk lacZ frompIC280 (Gambar S3). Protein ini tidak termasuk yang disintesis oleh WK10 / pIC280 di TGLP (data tidak ditampilkan). Ekspresi lacZ jauh di atas tingkat basal hanya pada sel N16961 / pIC280 yang tumbuh di TGLP (Gambar 2C dan S3) adalah indikasi kuat bahwa fragmen 280 bp berisi promotor yang dapat mengarahkan transkripsi yang efisien hanya di bawah batasan Pi, dalam sebuah PhoB Cara PhoB dependent memeriksa apakah PhoB secara langsung mengatur ekspresi pst2 di Vibrio cholerae O1, peneliti mencari urutan 280 bp untuk situs-situs PhoBbinding yang potensial. Satu motif kotak-kotak setengah-setengah putatif ditemukan berpusat, masing-masing, pada −80 dan −108 dari kodon inisiasi terjemahan pstS yang diusulkan (Gambar 2A). Urutan nukleotida dan lokasinya relatif terhadap pstS ORF sangat lestari di antara spesies Vibrio dan E. coli (Gambar. S4). Dalam yang terakhir, dua situs yang mengikat PhoB telah terdeteksi secara eksperimental, relatif terhadap situs awal transkripsi (Makino et al., 1988) (Gbr. S4). Untuk menyelidiki apakah PhoB secara fungsional berinteraksi dengan situs-situs pengikat PhoB yang diprediksi di upstream operon pst2 di sel Vibrio cholerae, peneliti melakukan EMSA menggunakan PhoB yang dimurnikan dan 280 bp segera upstream kod awal yang diusulkan pstS. PhoB memperlambat 280 bp probe biotin fragmen mobilitas sehingga menimbulkan pergeseran pita di EMSA gel (Gambar 2D). Penambahan fragmen 280 bp yang tidak berlabel ke reaksi pengikatan karena DNA pesaing menunjukkan perpindahan kompleks 280 bp-PhoB berlabel, yang menegaskan interaksi spesifik antara promotor pst2 dan PhoB. Bersamaan temuan ini memberikan bukti kuat bahwa gen pstS upstream ke 280 bp region berisi elemen yang diperlukan untuk transkripsi

operon Vibrio cholerae O1 pst2 sebagai respons terhadap pembatasan Pi, dengan PhoB dependent. 3.2 Pst2 operon intergenic region pstS-pstC pada Vibrio cholerae O1 mengandung urutan palindromic berulang yang dapat melipat menjadi struktur stem-loop E. coli, B. subtilis dan beberapa spesies Vibrio, region intergenik pstS-pstC bervariasi antara 70 dan 80 bp, sedangkan pada Vibrio cholerae strain O1 N16961 dan O395, hanya 14 pb pstS dan gen pstC yang terpisah (GenBank: AAF95984. 1, Genbank: YP_001214910.1). Hal ini mendorong peneliti untuk mengevaluasi daerah antara pstS dan pstC di Vibrio cholerae O1 N16961 dan strain O395, dengan menyelaraskan PstC N-terminal menyimpulkan urutan asam amino dengan homolog tersebut dari spesies Vibrio lain dan E. coli. Sekuen primer PstC tampaknya sangat konserv di antara spesies Vibrio (Gambar 3). Namun, protein dari kedua strain Vibrio cholerae O1 menunjukkan urutan N-terminal yang diperpanjang dari 21 residu (dalam abu-abu, Gambar. 4), sangat menunjukkan anotasi kesalahan pstC. Berdasarkan fakta-fakta ini, peneliti mengusulkan PstC dari Vibrio cholerae O1strain adalah 21 residu asam amino lebih pendek dari yang diprediksi dan menyajikan urutan MTIATN... sebagai ujung N-terminalnya dan sebagai homolognya

Gambar 3. Skuens vibrio (Multiple alignment) (Gambar 3). Ini meninggalkan wilayah intergenik pstS-pstC dengan 77 bp, seperti

pada spesies bakteri lainnya (Gambar 4A). Menariknya, analisis lebih lanjut dari region pstSpstC yang diprediksi dalam transkrip pertama dari berbagai spesies Vibrio, termasuk urutan 77 bp yang disarankan dari Vibrio cholerae N16961 dan O395, menunjukkan urutan palindromic berulang (REP) yang dapat melipat menjadi loopinduk (Gambar. S5), mirip dengan yang dijelaskan dalam E. coli dan B. subtilis. Perlu dicatat bahwa struktur ini secara keseluruhan organisasi, serta stabilitasnya, berdasarkan nilai ΔG (Energi Gibbs), adalah serupa (Gambar. S5). 3.3 Vibrio cholerae O1 pst2 operon ditranskripsi menjadi mRNA polikistronik yang diproses lebih lanjut menjadi transkrip kecil dari stabilitas yang berbeda. Pola transkripsi pst2 operon, PCR endpoint dilakukan menggunakan sampel cDNA yang dibuat dari sel Vibrio cholerae O1 N16961SR yang tumbuh di TGLP pada suhu 37°C selama 3 jam dan pasangan primer: PstSFw / PstCRv, PstCFw / PstARv dan PstAFw / PstBRv (Tabel 1). Untuk pengecualian amplifikasi karena kontaminasi DNA genom dalam sampel RNA, peneliti tersebut menggunakan RNA yang ditranskripsikan non-reverse sebagai template untuk PCR endpoint dan tidak ada produk amplifikasi yang diamati. Tiga fragmen DNA dari 1008, 1112 dan 662 bp diperoleh, mengandung, masing-masing, pstS-pstC, pstC-pstA dan pstA-pstB urutan gen (Gbr. 5), menunjukkan bahwa operon Vibrio cholerae pst2 ditranskripsikan sebagai fulllength polycistronicmRNA dari promoter upstream pstS, seperti yang diamati pada E. coli dan B. subtilis (Aguena dkk., 2002; Qi dan Hulett, 1998). Dalam E. coli dan B. subtilis, transkrip pst panjang penuh memiliki paruh yang sangat singkat, yang terdegradasi menjadi molekul yang lebih kecil oleh ribonuklease spesifik (Aguena et al., 2009; Allenby et al., 2004). Pada bakteri, pola degradasi RNA dapat ditentukan dengan memperlakukan sel dengan rifampisin, antibiotik yang secara khusus menghambat polimerase RNA bakteri (Jin dan Gross, 1988). Oleh karena itu, untuk menyelidiki pst2 mRNA stabilitas, Vibrio cholerae O1

N16961SR sel tumbuh di TGLP pada 37 ° C selama 3 jam dan kemudian diobati dengan rifampisin hingga 20 menit. Sampel RNA disiapkan dari non-treatmean (kontrol) dan sel yang diperlakukan rifampisin selama 0, 2,5, 5, 10 dan 20 menit dan tingkat transkrip individu ditentukan pada titik waktu yang ditunjukkan oleh qRT-PCR, menggunakan pasangan primer khusus untuk pstS, pstC, pstA dan pstB dan rpoB sebagai kontrol endogen. Efisiensi amplifikasi berkisar dari 97% hingga 105% (Gambar S7). Kelimpahan seluler dari transkrip pstS kemudian ditentukan dari waktu ke waktu relatif terhadap tingkat pstC, pstA dan pstB transkrip (Gambar 6). Dalam sel yang ditreatmean hingga 5 menit dengan rifampisin, tingkat transkrip pstS relatif sangat rendah terhadap pstC, pstA dan pstB dan serupa. Setelah 10 menit dengan rifampicin, kelimpahan seluler pstS tidak berubah secara signifikan terhadap tingkat transkrip pstB, tetapi meningkat, masing-masing, 15 dan 25 kali lipat dibandingkan dengan jumlah transkrip pstA dan pstC. Pola transkrip sekunder newpst2 muncul setelah 20 menit terpapar rifampicin. Kelimpahan transkrip ptS-encoding lebih tinggi dari pada 10 menit sel yang dirawat relatif terhadap tiga spesies lainnya. Ini sangat jelas sehubungan dengan tingkat transkrip pstC yang turun drastis dari waktu ke waktu, diikuti oleh yang spesifik untuk pstA dan pstB (Gambar 6). Transkrip paruh waktu yang tepat tidak dapat ditentukan dari hasil ini. Namun, mereka sangat menunjukkan bahwa pada sel Vibrio cholerae, seperti yang diamati pada spesies bakteri lainnya (Aguena et al., 2009; Allenby et al., 2004), operon pst2 ditranskripsi menjadi mRNA panjang penuh yang diproses menjadi bentuk sekunder. transkrip dari stabilitas yang berbeda, menguatkan data pada (Gambar.5). Di antara transkrip transkriponococronic mereka, mereka yang menyandikan pstS adalah stabil, diikuti oleh pstB, pstA dan pstC transkrip, dalam urutan ini. Pada E. coli, mRNA pst panjang penuh dipotong oleh endonuklease E (RNAse E) dalam dua daerah kaya AU, satu di dalam wilayah intergenik pstS-pstC, hilir dari dua loop induk,

dan yang lainnya antara pstA dan pstB (Aguena dan Leptospira, 2009; McDowall et al., 1994). Salah satu produk mRNA pemotongan mRNA oleh RNAse E dalam region intergenik pstSpstC pada E. coli adalah transkripsi pstS monocistronik yang mengandung dua batang-loop di 3 'wilayah tidak diterjemahkan (UTR). Struktur ini dalam molekul mRNA bertindak sebagai 3′-5′ exonuclease sinyal pemrosesan akhir, menjelaskan pstS monocistronik transkrip stabilitas yang lebih tinggi dan tingkat seluler PstS yang lebih tinggi relatif terhadap sistem transpor Pst protein lain dalam sel E. coli yang tumbuh di bawah batasan Pi (Newbury et al., 1987). Regulasi pascatranskripsi serupa telah dijelaskan untuk operon pst di B. subtilis (Allenby et al., 2004). Vibrio cholerae O1, RNAse E juga memproses RNA dengan mengenali motif-motif AU-kaya yang singlestand (Davis dan Waldor, 2007). Dengan menggunakan alat bioinformatika, peneliti mengidentifikasi dua lokasi pembelahan RNAse E yang potensial dalam translasi pst2 fulllength, satu di dalam wilayah intergenik pstS-pstC, hilir dari dua loop induk, dan satu lagi antara pstA dan pstB, seperti dalam E coli (Gambar 4A dan S8). Pembelahan dalam tempat atau situs tersebut akan menghasilkan monocistronic mRNAs mengkodekan PstS dan PstB menyajikan, masing-masing, dua loop-induk dan terminulator transkripsi Rhoindependen di 3′UTR daerah (Gambar. 4B dan 7), menjelaskan pstS dan pstB lebih tinggi karena mereka menyediakan penghalang terhadap degradasi nuklease (Gbr. 6).

Gambar 4. Nukleotida squens dan Struktur dari Psts)

Gambar 5. PCR Endpoint Fragmen dari Pst2 Vibrio) Gambar 6. pstS monositronik transkrip

BAB IV PENUTUP 4.1 Kesimpulan Sebagai respon terhadap pembatasan Pi, operon Vibrio cholerae O1 pst2 ditranskripsikan dengan cara PhoB-dependent ke dalam mRNA polikistronik yang diproses secara cepat menjadi transkrip kecil dari stabilitas yang berbeda. Molekul sekunder mRNA yang paling stabil adalah mRNA pengkode PstS, yang berkorelasi dengan baik dengan protein P -P pengikatan Pi periplasmik, dibandingkan dengan komponen sistem transporter Pst lainnya, dalam sel yang tumbuh dalam medium terbatas-Pi. Stabilitas relatif tinggi dari transkrip monocistronik pstS dan pstB tampaknya bergantung pada kondisi struktural dalam transkrip yang sesuai 3′UTR yang memberikan resistansi terhadap 3′-5 ′ eksonuklease. Langkah penting dari pekerjaan ini adalah reannotasi operon Vibrio cholerae O1 pst2, tidak hanya untuk menentukan kodon inisiasi pstS dan pstC terjemahan yang benar dan urutan intergenik pstS-pstC, tetapi juga untuk mengidentifikasi dan memvalidasi secara eksperimental elemen pengatur yang penting untuk operon. ekspresi di bawah batasan Pi (Gbr. 7). Penelitian ini juga menekankan pentingnya mengintegrasikan bioinformatika dan uji eksperimental untuk anotasi genom dan meningkatkan pemahaman kita tentang mekanisme yang mendasari regulasi ekspresi gen dalam kondisi tertentu.